Оборудование для ПЦР

В настоящее время метод ПЦР широко распространен как в медицине, так и в научных кругах. Это, прежде всего, связано с существенным подешевевшем оборудования и реактивов, используемых, в этом методе.  В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК с помощью особых ферментов ДНК-полимераз. Так называемая репликация ДНК. С помощью  ферментов, который тщательно подбирается к поставленной задачи, достигается практическое увеличение (в геометрической прогрессии) заданного фрагмента ДНК (репликация) что позволяет сделать его видимым для физической детекции.

 

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был изобретён в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. С 1986 года метод ПЦР запатентован[1]. В 1993 году учёный получил за изобретение ПЦР Нобелевскую премию по химии[2].

В настоящее время ПЦР широко используется в науке[3], медицине, а также в криминалистике[4]. Это во многом связано со снижением стоимости оборудования[5] и расходных материалов[6].

В основе метода ПЦР лежит процесс репликации (копирования) отдельных фрагментов ДНК с помощью ферментов ДНК-полимераз. В результате достигается увеличение (в геометрической прогрессии) заданного фрагмента ДНК, что позволяет сделать его видимым для физических методов детекции.

Метод ПЦР включает 3 основных этапа, обычно повторяющиеся 30-40 раз:

  1. денатурация (раскручивание спирали ДНК на отдельные нити)
  2. отжиг (образование комплекса специальной пары праймеров с исследуемой ДНК, ограничивающих начало и конец фрагмента для копирования,
  3. синтез копий фрагмента ДНК, ограниченного праймерами.

Для успешного проведения ПЦР важно подобрать оптимальные условия (состав раствора – буфера для ПЦР, температуры) для всех 3-х этапов процесса. При разработке условий ПЦР важно обращать внимание на участки отжига праймеров, состав праймеров, а также длину и состав получаемых фрагментов ДНК.

Помимо этого, важно правильно подготовить исследуемый образец, получить максимально чистую ДНК, удалить из биопрепарата посторонние примеси, способные ингибировать ПЦР. Для этого используют коммерческие наборы для выделения и очистки ДНК. Есть компании, специализирующиеся на разработке и производстве таких систем, например, компания QIAGEN[7].

Для научных исследований разработано множество вариаций метода ПЦР, все они имеют свои преимущества и недостатки:

В медицинской практике преимущественно используется комбинация Hot-start PCR и количественная ПЦР – ПЦР в реальном времени (real-time PCR). Метод позволяет в режиме реального времени следить за накоплением продукта реакции, оценить количество исследуемой ДНК в образце. Для этого используются специальные зонды – короткие молекулы ДНК, наподобие праймеров, соединённые с молекулами флуорофоров (соединения светятся при определённых условиях). Все инфекционные агенты имеют специфические участки ДНК, для поиска которых и разрабатываются зонды.

В некоторых лабораториях используют ПЦР с детекцией результатов по конечной точке – это качественный метод, способный указать на наличие или отсутствие исследуемой ДНК в образце. Детекцию осуществляют также с использованием флуоресцентных зондов, либо в агарозном геле – метод электрофореза.

Широкое распространение метода ПЦР привело к существенному развитию диагностике в медицине. С помощью ПЦР проводят раннюю диагностику не только наиболее распространенных инфекций, но и социально значимых инфекций.

  • изотермическая ПЦР (используются специальные ДНК-полимеразы и праймеры)
  • вложенная ПЦР
  • инвертированная ПЦР
  • ПЦР с обратной транскрипцией
  • асимметричная ПЦР
  • количественная ПЦР
  • ступенчатая ПЦР
  • метод молекулярных колоний (ПЦР в геле)
  • ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК
  • ПЦР длинных фрагментов
  • ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК
  • Групп-специфическая ПЦР
  • ПЦР с использованием горячего старта (Hot-start PCR)
  • Цифровая ПЦР (in silico PCR).

 

×