Фьюжн ДНК-полимераза (Pfu-Sso7d) 500 е.а.

Фьюжн ДНК-полимераза является рекомбинантным полипептидом, состоящим из слитых термостабильной ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus (Pfu) и ДНКсвязывающего белка термофильных архей вида Sulfolobus solfataricus (Sso7d).

Белок Sso7d связывается с малой бороздкой двухцепочечной ДНК и дополнительно стабилизирует комплекс полимеразы с матрицей. Благодаря этому Фьюжн ДНК-полимераза, обладает повышенной процессивностью, точностью синтеза, скоростью амплификации фрагментов и повышенной устойчивостью к ингибиторам ПЦР по сравнению с нативной Pfu ДНКполимеразой [1]. Фьюжн ДНК-полимераза обладает 5’→3’ полимеразной активностью, 3’→5’ экзонуклеазной активностью и синтезирует продукты с тупыми концами.

Область применения:

Фьюжн ДНК-полимераза является хорошим выбором для рутинного клонирования и может использоваться для получения методом ПЦР длинных или сложных ампликонов.

Примеры использования Фьюжн ДНК-полимеразы представлены в конце описания.

Источник

Фьюжн ДНК-полимераза выделена из штамма E.coli, содержащего плазмиду с клонированным фрагментом ДНК, состоящим из слитых генов термостабильной ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus (Pfu) и ДНК-связывающего белка Sulfolobus solfataricus (Sso7d).

Единицы активности

Одна единица активности соответствует количеству фермента, необходимому для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию ДНК за 30 мин при 74°С.

Концентрация фермента и фасовки: 2 е.а./мкл.

Буфер хранения:

Фермент находится в растворе следующего состава: 20 мМ Tris-HCl (рН 7,5 при 25°C), 100 мМ KCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл БСА, 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 50% глицерин.

Контроль качества:

Каждая партия фермента тестируется на активность фермента, электрофоретическую чистоту в SDS-ПААГ, отсутствие неспецифической нуклеазной активности.

Протокол проведения стандартной реакции ПЦР:

1. Смешайте индивидуальные компоненты в пробирке согласно таблице (для оптимального результата при замешивании реакционной смеси держите компоненты и реакционную смесь во льду):

¹ буфер поставляется с ферментом: 1,3 мл для Е-11001 и 6,5 мл для Е-11005 (1x буфер содержит 2 мМ MgCl2).

² концентрация праймеров может варьировать в пределах 10-500 нМ.

³ для геномной ДНК рекомендуется использовать от 50 до 250 нг на реакцию, для плазмид и ДНК вирусов – от 1 до 10 нг.

2. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и «сбросьте капли» с помощью непродолжительного центрифугирования.

3. Перенесите пробирку с реакционной смесью в предварительно нагретый амплификатор (95-98°С).

4. Используйте следующую программу для стандартной ПЦР:

¹ при амплификация больших фрагментов (≥ 5 т.п.н.) рекомендуется пропускать данную стадию

5. Проанализируйте продукты ПЦР в агарозном геле. Образцы предварительно необходимо смешать с буфером для внесения образцов в гель (например, с D-3002).

Условия хранения и транспортировки:

Хранить при температуре –20°C.

Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение трех суток.

Ссылки

Wang Y. et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro //Nucleic acids research. – 2004. – Т.32. – №. 3. – С. 1197-1207. DOI: 10.1093/nar/gkh271

Примеры использования Фьюжн ДНК-полимеразы в сравнении с Pfu ДНКполимеразой, взятой в качестве предшественника при конструировании Фьюжн ДНК-полимеразы.

За основу реакций использовали условия, описанные в работе Wang Y. с соавторами [DOI: 10.1093/nar/gkh271]. Матрицей служила ДНК фага лямбда 0,5 нг/мкл, структура праймеров указана в упомянутой работе, схема реакции 2х стадийная, общее количество циклов – 25.

1. Сравнение способности Фьюжн ДНК-полимеразы и Pfu ДНК-полимеразы синтезировать длинные фрагменты. Время элонгации везде составляло 7,5 мин. М – ДНК маркер «Sky-High» (S-8000).

2. Анализ скорости синтеза фрагментов ДНК с помощью Фьюжн ДНК-полимеразы. Изменялось только время элонгации (4 и 3 минуты, соответственно).

3. Анализ устойчивости к солям Pfu ДНК-полимеразы и Фьюжн ДНК-полимеразы на примере амплификации фрагмента размером 0,9 Kb в присутствии хлорида калия. Время элонгации 1 мин. Дорожки: 0-170, образцы с добавлением в реакционные смеси хлорида калия до 170 мМ, соответственно; М – ДНК маркер «Step 100» (S-8100).

4. Анализ устойчивости к гуанидин гидрохлориду Pfu ДНК-полимеразы и Фьюжн ДНК-полимеразы на примере амплификации фрагмента размером 2 Kb в присутствии гуанидин гидрохилорида. Время элонгации 2 мин. Дорожки: 0-80, образцы с добавлением в реакционные смеси гуанидин гидрохилорида до 80 мМ, соответственно; М – ДНК маркер «Sky-High» (S-8000).

5. Анализ устойчивости к цитрату натрия Pfu ДНК-полимеразы и Фьюжн ДНКполимеразы на примере амплификации фрагмента размером 2 Kb в присутствии цитрата натрия. Время элонгации 2 мин. Дорожки: 0-8, образцы с добавлением в реакционные смеси цитрата натрия до 8 мМ, соответственно; М – ДНК маркер «Sky-High» (S-8000).

6. Анализ устойчивости к додецилсульфату натрия (SDS) Pfu ДНК-полимеразы и Фьюжн ДНК-полимеразы на примере амплификации фрагмента размером 2 Kb в присутствии SDS. Время элонгации 2 мин. Дорожки: 0-0.04, образцы с добавлением в реакционные смеси SDS до 0,04%, соответственно; М – ДНК маркер «Sky-High» (S-8000).