Набор D-cells для выделения ДНК из клеток животных и бактерий, 250 реакц (колонки)

Набор предназначен для выделения и очистки ДНК из следующих образцов:

1. культуры клеток млекопитающих
2. культуры клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий

Принцип действия набора основан на селективной сорбции нуклеиновых кислот из предварительно лизированного образца на мембране из диоксида кремния, последующей промывке и элюции очищенного продукта. Лизис образца происходит в присутствии протеиназы K.

Выделенная ДНК может быть использована для проведения ПЦР, ник-трансляции, секвенирования и др.

Состав набора

Набор D-Cells-250 поставляется в одном из двух вариантов

Меры предосторожности

Осторожно! Буферы для лизиса LB и для промывки WB1 содержат раствор хаотропной соли, оказывающий раздражающее и токсичное действие. При работе необходимо соблюдать правила общей и личной техники безопасности.

Токсичен при попадании на кожу и внутрь. Вызывает ожоги.

Осторожно! Буферы для промывки WB1 и WB2 содержат изопропанол, оказывающий раздражающее и токсичное действие. Не проводить работы с раствором в непосредственной близости от открытого огня.

При попадании на кожу промойте немедленно большим количеством воды и моющего средства (детергента). При необходимости обратитесь за медицинской помощью.

Эксплуатация

Компоненты: PBS, LB, WB1, WB2, EB, Буфер для растворения лизоцима, протеиназа K стабильны в течение всего срока годности при соблюдении условий хранения (см. на упаковке) и достаточной герметизации флаконов.

Внимание! Не нагревать набор выше температуры +25°C, несоблюдение температурного режима хранения и транспортировки снижает активность протеиназы К и эффективность выделения.

Внимание! не хранить смесь буфера для лизиса LB и протеиназы K.

Условия работы

Температура окружающей среды от +15 до +25°С;

Относительная влажность воздуха не более 80 %;

Атмосферное давление 630 – 800 мм. рт. ст.

Оборудование и материалы, не входящие в набор

• Твердотельный термостат, поддерживающий температуру 56 °С;
• Центрифуга для микропробирок на 1.5-2 мл, скорость 12000 rcf;
• Вортекс;
• Одноканальные дозаторы переменного объёма и наконечники для них;
• Опционально. Лизоцим;
• Перчатки резиновые;
• Микропробирки на 1.5 мл.

Протокол выделения ДНК.

1) Подготовка и лизис образцов.

- Культуры клеток животных. Монослойные культуры.

1. Снять клетки с поверхности культурального пластика методом, используемым в лаборатории, или стандартным методом, рекомендуемым для данной культуры клеток.
2. Перенести образец суспензии клеток (не более 2-3*106 клеток) в одноразовую микропробирку.
3. Осадить клетки центрифугированием 3 мин, 1000 rcf. Аккуратно отобрать супернатант. Ресуспендировать осадок клеток в 150 мкл PBS.
4. Чистым одноразовым наконечником добавить 150 мкл буфера для лизиса LB и 20 мкл протеиназы K.
5. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
6. Инкубировать 10 мин при температуре 56⁰C.
7. Добавить к образцу 500 мкл буфера для лизиса LB.
8. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
9. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (15-25°C).

- Культуры клеток животных. Монослойные культуры. Культуральные планшеты.

При работе с 12-, 24- или 96-луночными планшетами или с культуральной посудой с аналогичной площадью ячейки допускается лизис непосредственно в лунке.

1. Удалить культуральную среду из лунки планшета
2. В лунку 12-луночного планшета добавить 150 мкл PBS, 250 мкл буфера для лизиса LB, В лунку 24- или 96-луночного планшета добавить 100 мкл PBS и 100 мкл буфера для лизиса LB.
3. Инкубировать 3-5 минут. Аккуратно, избегая пенообразования, перемешать содержимое лунки пипетированием, убедиться, что клетки открепились от ячейки.
4. Чистым одноразовым наконечником перенести образец в одноразовую микропробирку. Добавить 20 мкл протеиназы K.
5. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
6. Инкубировать 10 мин при температуре 56⁰C.
7. Добавить к образцу 400 мкл (12-луночный планшет) или 600 мкл (24- или 96-
8. очный планшет) буфера для лизиса LB.
9. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (15-25°C).

- Культуры клеток животных. Суспензионные культуры.

1. Перенести образец суспензии клеток (не более 2-3*106 клеток) в одноразовуюмикропробирку.
2. Осадить клетки центрифугированием 3 мин, 1000 rcf. Аккуратно отобрать супернатант. Ресуспендировать осадок клеток в 150 мкл PBS.
3. Чистым одноразовым наконечником добавить 150 мкл буфера для лизиса LB и 20 мкл протеиназы K.
4. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
5. Инкубировать 10 мин при температуре 56 ⁰C.
6. Добавить к образцу 500 мкл буфера для лизиса LB.
7. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (15-25 ⁰C).

- Культуры клеток бактерий. Грамотрицательные бактерии.

1. Перенести 0.5-2 мл суспензии ночной культуры клеток (не более 1*108 клеток) в одноразовую микропробирку.
   Примечание: при работе с культурами клеток E.Coli рекомендуется использовать не более 0.5 мл ночной культуры клеток.
2. Осадить клетки центрифугированием 1 мин, 10000 rcf. Аккуратно отобрать супернатант. Ресуспендировать осадок клеток в 150 мкл PBS.
3. Чистым одноразовым наконечником добавить 150 мкл буфера для лизиса LB и 20 мкл протеиназы K.
4. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
5. Инкубировать 10 мин при температуре 56⁰C.
6. Добавить к образцу 500 мкл буфера для лизиса LB.
7. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли короткимцентрифугированием. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (15-25⁰C).

- Культуры клеток бактерий. Грамположительные бактерии

Подготовка раствора лизоцима:

• К навеске лизоцима чистым одноразовым наконечником добавить необходимый объём буфера для растворения лизоцима (входит в состав набора), чтобы получить раствор 50 мг/мл.
• Тщательно перемешать на вортексе.
• Инкубировать 30 мин при Tкомн (15-25°C), периодически перемешивая до полного растворения лизоцима.
• Хранить при -20°C.

1. Перенести 0.5-2 мл суспензии ночной культуры клеток (не более 1*108 клеток) в одноразовую микропробирку.
2. Осадить клетки центрифугированием 1 мин, 10000 rcf. Аккуратно отобрать супернатант. Ресуспендировать осадок клеток в 150 мкл PBS.
3. Чистым одноразовым наконечником добавить 30 мкл раствора лизоцима (50 мг/мл) в буфере для растворения лизоцима (50 мМ Tris-HCl (pH 8), 10 мМ EDTA (pH 8), 50% глицерин).
   Примечание: лизоцим не входит в набор, буфер для растворения лизоцима поставляется вместе с набором. Раствор лизоцима хранить в буфере для растворения лизоцима не более 6 месяцев при -20⁰C.
4. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием. Инкубировать 10 мин при Tкомн (15-25⁰C).
5. Чистым одноразовым наконечником добавить 50 мкл буфера для лизиса LB и 20 мкл протеиназы K.
6. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием.
7. Инкубировать 10 мин при температуре 56⁰C.
8. Добавить к образцу 600 мкл буфера для лизиса LB.
9. Перемешать образец на вортексе 5-10 с. Сбросить капли коротким центрифугированием. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (15-25⁰C).

2) Нанесение на колонку.

1. Перенести 800 мкл лизата на колонку. Плотно закрыть крышку колонки.
2. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
   Примечание: если после центрифугирования часть раствора осталась на колонке, повторить центрифугирование увеличив время и/или скорость центрифугирования, не добавляя новую порцию образца или буфера LB.
   Примечание: если объём лизата больше 800 мкл, повторно нанести избыток на ту же колонку и повторить центрифугирование.

3) Промывка колонки.

1. Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB1. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
2. Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB2. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
3. Центрифугировать колонку 3 мин, 12000 rcf для полного удаления буфера WB2.

4) Элюция ДНК.

1. Перенести колонку в новую микропробирку на 1.5-2 мл (не входит в состав набора). Плотно прижать колонку к пробирке.
2. Нанести на центр фильтра колонки от 60 до 200 мкл буфера для элюции EB. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре (15-25⁰C). Центрифугировать 1 мин, 10000 rcf.
   • Важно! Рекомендуемый объём элюции 100 мкл. При элюции меньшим объёмом требуется аккуратно наносить аликвоту буфера на центр фильтра колонки, иначе возможно снижение выхода ДНК.
   • При элюции в 100-200 мкл выход ДНК выше на 10-30%, чем при элюции в 60 мкл.
   • Повторная элюция новой аликвотой буфера для элюции EB или элюатом позволяет увеличить выход ДНК на 10-30%. При элюции объёмом менее 100 мкл рекомендуется использовать новую аликвоту буфера для элюции. При элюции объёмом 100 мкл и более допускается повторно нанести элюат на колонку.
   • Буфер для элюции - 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Элюировать образец также можно TE буфером (0.01 М Tris-HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
3. Элюат, содержащий ДНК, хранить при -20⁰C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.

Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.

Анализ выделенной ДНК

Целостность выделенной ДНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле.

Количество выделенной ДНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии.

Характерный максимум поглощения для ДНК при λ = 260 нм.

Посчитать концентрацию ДНК (мкг/мл) можно по следующей формуле:
A₂₆₀ * разбавление * 50 мкг/мл.

Характерные соотношения оптической плотности A₂₆₀/A₂₈₀ ~1.7-2.0.

Дополнительные реагенты:

• Буферы для электрофореза в агарозном геле: трис-ацетатный буфер (Кат. № BE-DNA-500, BE-DNA-1000), трис-боратный буфер (Кат. № TBE-500).
• Раствор бромистого этидия (Кат. № EtBr-10) для визуализации НК.
• Буферы для внесения образцов ДНК и РНК в гель (Кат. № D-3001, D-3002, D-3003).
• Маркеры молекулярных весов ДНК (Кат. № S-8000, S-8100, S-8103, S-8055, S-8250, S-8150).

Условия хранения:

Набор для выделения ДНК хранить при температуре от +15 до +25 °C. Раствор протеиназы K хранить при температуре от -18 до -24°C. Срок годности см. на упаковке.

Условия транспортировки:

Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.

Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение 14 суток.