Набор для выделения геномной ДНК из клеток, тканей и крови, 250 реакций (колонки)

Набор предназначен для выделения и очистки геномной ДНК из следующих образцов:

1. Культуры эукариотических клеток;
2. Культуры клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий;
3. Тканей животных и растений;
4. Кровь.

Принцип действия набора основан на селективной сорбции нуклеиновых кислот из предварительно лизированного образца на кремниевой мембране, последующей промывке и элюции очищенного продукта. Возможно выделение до 30-50 мкг ДНК.

Выделенная ДНК может быть использована для ПЦР, ник-трансляции и других генно-инженерных приложений.

Состав набора

Набор DU-250 поставляется в одном из двух вариантов

Меры предосторожности

Осторожно! Буферы для лизиса LB и для промывки WB1 содержат раствор хаотропной соли, оказывающий раздражающее и токсичное действие. При работе необходимо соблюдать правила общей и личной техники безопасности. Токсичен при попадании на кожу и внутрь. Вызывает ожоги.

При попадании на кожу промойте немедленно большим количеством воды и моющего средства (детергента). При необходимости обратитесь за медицинской помощью.

Эксплуатация

Компоненты: LB, WB1, WB2, EB стабильны в течение всего срока годности при соблюдении условий хранения (см. на упаковке) и достаточной герметизации флаконов.

Условия работы

Температура окружающей среды от +15 до +25°С;

Относительная влажность воздуха не более 80 %;

Атмосферное давление 630 – 800 мм. рт. ст.

Оборудование и материалы, не входящие в набор

• Центрифуга для микропробирок на 1.5-2 мл, скорость 10000 rcf;
• Вортекс;
• Одноканальные дозаторы переменного объёма и наконечники для них;
• Перчатки резиновые;
• Микропробирки на 1.5-2.0 мл;
• Этанол, 96-100% раствор;
• Лизоцим, при выделении ДНК из грамположительных бактерий.

Перед началом работы

Подготовка буфера WB2.

- 1 выделение, 500 мкл WB2.К 100 мкл буфера WB2 (концентрат) добавить 400 мкл этанола (96-100%).

- 10 выделений. К 1.1 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 4.4 мл этанола (96-100%), чтобы получить 5.5 мл буфера WB2.

- 50 выделений. К 6 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 24 мл этанола (96-100%), чтобы получить 30 мл буфера WB2.

- 250 выделений. Вариант 1. К 10 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 40 мл этанола (96-100%), чтобы получить 50 мл буфера WB2.

- 250 выделений. Вариант 2. К 15 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 60 мл этанола (96-100%), чтобы получить 75 мл буфера WB2.

После добавления этанола плотно закрывать крышку. Рекомендуется добавлять этанол к аликвоте буфера WB2, поскольку при хранении буфера с этанолом в течение нескольких месяцев этанол может частично испариться.

Протокол выделения ДНК.

Внимание! При работе с биологическими жидкостями следует надевать одноразовые резиновые перчатки, так как исследуемый материал является потенциально инфицированным, способным длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции. Все использованные материалы дезинфицировать в соответствии с требованиями МУ-287-113.

1) Подготовка и лизис образцов

- Осадок культур эукариотических и бактериальных клеток, лимфоцитов.

1. Осадок клеток ресуспендировать в 50 мкл PBS.
   Примечание: не использовать более 5*106 клеток млекопитающих или лимфоцитов и более 1*108 клеток бактерий.
   Примечание: при выделении ДНК из грамположительных бактерий добавить 30 мкл раствора лизоцима (50 мг/мл) в TE буфере (0.01 М Tris-HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0). Инкубировать 10 мин при Tкомн (15-25 ⁰C).
2. Чистым одноразовым наконечником добавить 600 мкл буфера для лизиса LB.
3. Перемешать образец на вортексе 5-10 с или пипетированием.
4. Сбросить капли коротким центрифугированием.
5. Инкубировать 10 мин при 15-25⁰C.

- Ткани животных и растений

1. Навеску ткани поместить в чистую микропробирку 1.5-2.0 мл.
   Примечание: использовать не более 20-30 мг тканей животных (более 10-15 мг селезёнки), не более 50-100 мг свежих тканей растений, не более 20-30 мг сухих тканей растений.
2. Чистым одноразовым наконечником добавить 600 мкл буфера для лизиса LB. Гомогенизировать образец.
3. Сбросить капли коротким центрифугированием.
4. Инкубировать 10 мин при 15-25 ⁰C.
5. Центрифугировать лизат 1 мин, 10000 rcf.

- Цельная кровь

1. 200 мкл образца крови перенести в чистую микропробирку на 1.5-2.0 мл.
2. Чистым одноразовым наконечником добавить 750 мкл буфера для лизиса LB.
   Примечание: при выделении из 100 мкл рекомендуется также использовать 750 мкл буфера LB.
3. Перемешать образец на вортексе 5-10 с или пипетированием.
4. Сбросить капли коротким центрифугированием.
5. Инкубировать 10 мин при 15-25 ⁰C.

2) Нанесение на колонку

1. Перенести не более 800 мкл лизата или супернатанта (в случае тканей) на колонку. Плотно закрыть крышку колонки.
2. Центрифугировать 30 с, 10000 rcf. Удалить фильтрат.
   Примечание: если после центрифугирования часть раствора осталась на колонке, повторить центрифугирование увеличив время и/или скорость центрифугирования, не добавляя новую порцию образца или буфера LB.
   Примечание: если объём лизата больше 800 мкл, повторно нанести избыток на ту же колонку и повторить центрифугирование.

3) Промывка колонки

1. Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB1. Центрифугировать 30 с, 10000 rcf. Удалить фильтрат.
2. Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB2. Центрифугировать 30 с, 10000 rcf. Удалить фильтрат.
   Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WB2 этанол.
3. Центрифугировать колонку 3 мин, 10000 rcf для полного удаления буфера WB2.

4) Элюция ДНК

1. Перенести колонку в новую микропробирку на 1.5-2 мл (не входит в состав набора). Плотно прижать колонку к пробирке.
2. Нанести на центр фильтра колонки от 60 до 200 мкл буфера для элюции EB. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре (15-25⁰C). Центрифугировать 1 мин, 10000 rcf.
   • Важно! Рекомендуемый объём элюции 100 мкл. При элюции меньшим объёмом требуется аккуратно наносить аликвоту буфера на центр фильтра колонки, иначе возможно снижение выхода ДНК.
   • При элюции в 100-200 мкл выход ДНК выше на 10-30%, чем при элюции в 60 мкл.
   • Повторная элюция новой аликвотой буфера для элюции EB или элюатом позволяет увеличить выход ДНК на 10-30%. При элюции объёмом менее 100 мкл рекомендуется использовать новую аликвоту буфера для элюции. При элюции объёмом 100 мкл и более допускается повторно нанести элюат на колонку.
   • Буфер для элюции - 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Элюировать образец также можно TE буфером (0.01 М Tris-HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
3. Элюат, содержащий ДНК, хранить при -20°C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.

Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.

Анализ выделенных ДНК или РНК

Целостность выделенной ДНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле.

Количество выделенной ДНК из можно оценить с помощью УФ-спектрометрии.

Характерный максимум поглощения для ДНК при λ = 260 нм.

Посчитать концентрацию ДНК (мкг/мл) можно по следующей формуле:
A₂₆₀ * разбавление * 50 мкг/мл.

Характерные соотношения оптической плотности A₂₆₀/A₂₈₀ ~1.8-2.0.

Дополнительные реагенты:

В каталоге ООО «Биолабмикс» представлены реагенты и материалы полезные при выделении ДНК и её анализе.

• Стерильные пестики для гомогенизации образцов тканей в микропробирках (Кат. № pest-10).
• Буферы для электрофореза в агарозном геле: трис-ацетатный буфер (Кат. № BE-DNA-500, BE-DNA-1000), трис-боратный буфер (Кат. № TBE-500).
• Раствор бромистого этидия (Кат. № EtBr-10) для визуализации НК.
• Буферы для внесения образцов ДНК и РНК в гель (Кат. № D-3001, D-3002, D-3003).
• Маркеры молекулярных весов ДНК (Кат. № S-8000, S-8100, S-8103, S-8055, S-8250, S-8150).
• Протеиназа K (Кат. № EP-1200).
• РНКаза A (Кат. № ER-500).

Условия хранения:

Набор для выделения ДНК хранить при температуре от +15 до +25 °C. Срок годности см. на упаковке.

Условия транспортировки:

Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.