
Доставка
Возврата
Поддержка
- Самовывоз - бесплатно;
- Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
(Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)
Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):
- при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
- при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;
Подробнее о доставке.
Набор предназначен для выделения и очистки плазмидной ДНК из культур бактериальных клеток E. coli. Для выделения ДНК возможно использовать до 5 мл суспензии клеток (в зависимости от копийности и длины плазмиды).
Протокол состоит из двух основных этапов: щелочной лизис бактериальных клеток и последующая сорбция плазмидной ДНК на центрифужной колонке, промывка и элюция очищенного продукта. Ёмкость колонки до 30 мкг. Буфер для лизиса содержит pH-индикатор синего цвета, для лучшего контроля на этапе нейтрализации. После этапа нейтрализации цвет смеси становится прозрачным.
Выделенная ДНК может быть использована для ПЦР, рестрикции, секвенирования, трансформации, трансфекции и других приложений.
Состав набора
Plasmid-10 mini 10 выделений | Plasmid-50 mini 50 выделений | Plasmid-250 mini 250 выделений | ||
Вариант 1 | Вариант 2 | |||
Буфер для суспендирования SB | 3 мл | 15 мл | 2х50 мл | 100 мл |
Буфер для лизиса LB (содержит pH-индикатор) | 3 мл | 15 мл | 5x15 мл | 5x15 мл |
Буфер для нейтрализации NB | 3 мл | 15 мл | 2х50 мл | 100 мл |
Буфер для промывки WB1 | 5.5 мл | 30 мл | 3x50 мл | 2x75 мл |
Буфер для промывки WB2 (концентрат) | 1.1 мл | 6 мл | 3x10 мл | 2x15 мл |
Буфер для элюции EB | 5 мл | 15 мл | 60 мл | 60 мл |
РНКаза A, 10 мг/мл | 25 мкл | 115 мкл | 550 мкл | 550 мкл |
Пробирки для сбора фильтрата с колонками для сорбции образца | 10 шт. | 50 шт. | 250 шт. | 250 шт. |
Набор Plasmid-250-mini поставляется в одном из двух вариантов
Меры предосторожности
Осторожно! Буферы для лизиса LB, нейтрализации NB и промывки WB1 содержат вещества, оказывающие раздражающее и токсичное действие. При работе необходимо соблюдать правила общей и личной техники безопасности.
Токсичен при попадании на кожу и внутрь. Вызывает ожоги.
Осторожно! Буфер для промывки WB1 содержит изопропанол, оказывающий раздражающее и токсичное действие. Не проводить работы с раствором в непосредственной близости от открытого огня.
При попадании на кожу промойте немедленно большим количеством воды и моющего средства (детергента). При необходимости обратитесь за медицинской помощью.
Эксплуатация
Компоненты: SB, LB, NB, WB1, WB2, EB, РНКаза A стабильны в течение всего срока годности при соблюдении условий хранения (см. на упаковке) и достаточной герметизации флаконов.
Внимание! Не нагревать набор выше температуры +25°C, несоблюдение температурного режима хранения и транспортировки снижает активность РНКазы A и эффективность выделения.
Условия работы
Температура окружающей среды от +15 до +25°С;
Относительная влажность воздуха не более 80 %;
Атмосферное давление 630 – 800 мм. рт. ст.
Оборудование и материалы, не входящие в набор
- Центрифуга для микропробирок на 1.5-2 мл, скорость 12000 rcf;
- Одноканальные дозаторы переменного объёма и наконечники для них;
- Перчатки резиновые;
- Микропробирки на 1.5 мл;
- Этанол, 96-99% раствор.
Перед началом работы:
Подготовка буфера WB2.
- 1 выделение, 500 мкл WB2. К 100 мкл буфера WB2 (концентрат) добавить 400 мкл этанола.
- 10 выделений. К 1.1 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 4.4 мл этанола, чтобы получить 5.5 мл буфера WB2.
- 50 выделений. К 6 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 24 мл этанола, чтобы получить 30 мл буфера WB2.
- 250 выделений. Вариант 1. К 10 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 40 мл этанола, чтобы получить 50 мл буфера WB2.
- 250 выделений. Вариант 2. К 15 мл буфера WB2 (концентрат) добавить 60 мл этанола, чтобы получить 75 мл буфера WB2.
Рекомендуется добавлять этанол к аликвоте буфера WB2, поскольку при хранении буфера с этанолом в течение нескольких месяцев этанол может частично испариться.
Протокол выделения плазмидной ДНК
Для выделения плазмидной ДНК использовать 1-5 мл суспензии бактериальных клеток (количество зависит от копийности и длины плазмиды).
Все процедуры проводить при 15-25⁰C.
1) Подготовка и лизис образцов.
- Осадить бактериальные клетки из культуральной среды центрифугированием, 1 мин, 12000 rcf либо использовать принятый в лаборатории протокол для осаждения бактериальных клеток. Удалить супернатант.
- К осадку клеток добавить 250 мкл буфера SB. Ресуспендировать осадок пипетированием.
- К суспензии клеток добавить 2 мкл РНКазы A (10 мг/мл) и 250 мкл буфера для лизиса LB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси. Не использовать вортекс!
Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.
Примечание: Буфер для лизиса LB содержит pH-индикатор синего цвета. - Инкубировать полученную смесь не более 3 мин.
- Добавить 250 мкл буфера для нейтрализации NB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси. Инкубировать 5 минут.
Примечание: не использовать вортекс!
Примечание: перемешать суспензию сразу после добавления буфера NB, чтобы избежать образования крупных частиц. Перемешивать суспензию до полного исчезновения частиц синего цвета. - Центрифугировать 15 мин, 12000 rcf.
2) Нанесение на колонку.
Супернатант нанести на колонку. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
Примечание: если не все частицы осели на дно после центрифугирования, аккуратно переносить супернатант на колонку, избегая захвата осадка.
3) Промывка колонки.
- Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB1. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
- Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB2. Центрифугировать 30 с, 12000 rcf. Удалить фильтрат.
Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WB2 этанол. - Центрифугировать колонку 3 мин, 12000 rcf для полного удаления буфера WB2.
4) Элюция ДНК.
- Перенести колонку в новую микропробирку на 1.5-2 мл (не входит в состав набора). Плотно прижать колонку к пробирке.
- Нанести на центр фильтра колонки от 60 до 200 мкл буфера для элюции EB. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре (15-25⁰C). Центрифугировать 1 мин, 10000 rcf.
- Важно! Рекомендуемый объём элюции 100 мкл. При элюции меньшим объёмом требуется аккуратно наносить аликвоту буфера на центр фильтра колонки, иначе возможно снижение выхода ДНК.
- При элюции в 100-200 мкл выход ДНК выше на 10-30%, чем при элюции в 60 мкл.
- Повторная элюция новой аликвотой буфера для элюции EB или элюатом позволяет увеличить выход ДНК на 10-30%. При элюции объёмом менее 100 мкл рекомендуется использовать новую аликвоту буфера для элюции. При элюции объёмом 100 мкл и более допускается повторно нанести элюат на колонку.
- Буфер для элюции - 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Элюировать образец также можно TE буфером (0.01 М Tris-HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
- Элюат, содержащий ДНК, хранить при -20°C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.
Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.
Анализ выделенной ДНК
Целостность выделенной ДНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле.
Количество выделенной ДНК из можно оценить с помощью УФ-спектрометрии.
Характерный максимум поглощения для ДНК при λ = 260 нм.
Посчитать концентрацию ДНК (мкг/мл) можно по следующей формуле:
A260 * разбавление * 50 мкг/мл.
Характерные соотношения оптической плотности A260/A280 ~1.7-2.0.
Дополнительные реагенты:
В каталоге ООО «Биолабмикс» представлены реагенты для проведения агарозного гель-электрофореза.
- Буферы для электрофореза в агарозном геле: трис-ацетатный буфер (Кат. № BE-DNA-500, BE-DNA-1000), трис-боратный буфер (Кат. № TBE-500).
- Раствор бромистого этидия (Кат. № EtBr-10) для визуализации НК.
- Буферы для внесения образцов ДНК и РНК в гель (Кат. № D-3001, D-3002, D-3003).
- РНКаза A (Кат. № ER-500).
Условия хранения:
Набор для выделения ДНК хранить при температуре от +15 до +25 °C. Раствор РНКазы A хранить при температуре от -18 до -24°C. Срок годности см. на упаковке.
Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.
Условия транспортировки:
Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.
Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение 14 суток.
Вы смотрели
Комментарии (0)