Набор для выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток методом осаждения 12 выделений

Набор предназначен для выделения и очистки плазмидной ДНК из культур бактериальных клеток E. coli методом осаждения, без использования метода фенол-хлороформной экстрации или сорбционных методов (магнитные частицы или центрифужные колонки). Для выделения ДНК возможно использовать от 1 до 100 мл суспензии клеток (в зависимости от объема используемых пробирок и также копийности и длины плазмиды).

Набор представлен в трёх форматах:

• Формат «mini» - выделение плазмидной ДНК из 1-5 мл ночной культуры E. coli в центрифужных пробирках объёмом 1.5 мл.
• Формат «midi» - выделение плазмидной ДНК из 5-50 мл ночной культуры E. coli в центрифужных пробирках объёмом 15 мл.
• Формат «maxi» - выделение плазмидной ДНК из 50-100 мл ночной культуры E. coli в центрифужных пробирках объёмом 50 мл.

Протокол состоит из двух основных этапов: щелочной лизис бактериальных клеток и последующее осаждение плазмидной ДНК, промывка и растворение очищенного продукта. Буфер для лизиса содержит pH-индикатор синего цвета, для лучшего контроля на этапе нейтрализации. После этапа нейтрализации цвет смеси становится прозрачным.

Выделенная ДНК может быть использована для ПЦР и рестрикции.

Состав набора

Меры предосторожности

Осторожно! Буферы для лизиса LB, нейтрализации NB и осаждения PS содержат вещества, оказывающие раздражающее и токсичное действие. При работе необходимо соблюдать правила общей и личной техники безопасности.

Токсичен при попадании на кожу и внутрь. Вызывает ожоги.

Осторожно! Буфер для осаждения PS содержит изопропанол, оказывающий раздражающее и токсичное действие. Не проводить работы с раствором в непосредственной близости от открытого огня.

При попадании на кожу промойте немедленно большим количеством воды и моющего средства (детергента). При необходимости обратитесь за медицинской помощью.

Эксплуатация

Компоненты: SB, LB, NB, PS, WS, DB, РНКаза A стабильны в течение всего срока годности при соблюдении условий хранения (см. на упаковке) и достаточной герметизации флаконов.

Внимание! Не нагревать набор выше температуры +25°C, несоблюдение температурного режима хранения и транспортировки снижает активность РНКазы A и эффективность выделения.

Условия работы

Температура окружающей среды от +15 до +25°С;

Относительная влажность воздуха не более 80 %;

Атмосферное давление 630 – 800 мм. рт. ст.

Оборудование и материалы, не входящие в набор

• Центрифуга с охлаждением, скорость от 12000 rcf, охлаждение до +4 °C;
• Угловые роторы для пробирок объемом 1.5 мл (кат. № PP-50-mini), 15 мл (кат. № PP-20-midi), 50 мл (кат. № PP-12-maxi);
• Центрифужные пробирки объемом 1.5 мл (кат. № PP-50-mini), 15 мл (кат. № PP20-midi), 50 мл (кат. № PP-12-maxi);
• Одноканальные дозаторы переменного объёма и наконечники для них;
• Перчатки резиновые;
• Этанол, 96-100% раствор.

Перед началом работы:

Подготовка буфера WS.

- 1 промывка, 500 мкл WS. Кат. № PP-50-mini. К 100 мкл буфера WS (концентрат) добавить 400 мкл этанола (96-100%).

- 1 промывка, 2 мл WS. Кат. № PP-20-midi. К 0.4 мл буфера WS (концентрат) добавить 1.6 мл этанола (96-100%).

- 1 промывка, 7 мл WS. Кат. № PP-12-maxi. К 1.4 мл буфера WS (концентрат) добавить 5.6 мл этанола (96-100%).

- 1 флакон. Кат. № PP-50-mini. К 6 мл буфера WS (концентрат) добавить 24 мл этанола (96-100%), чтобы получить 30 мл буфера WS.

- 1 флакон. Кат. № PP-20-midi, PP-12-maxi. К 10 мл буфера WS (концентрат) добавить 40 мл этанола (96-100%), чтобы получить 50 мл буфера WS.

После добавления этанола плотно закрывать крышку. Рекомендуется добавлять этанол к аликвоте буфера WS, поскольку при хранении буфера с этанолом в течение нескольких месяцев этанол может частично испариться.

Протокол выделения плазмидной ДНК

Для выделения плазмидной ДНК использовать 1-100 мл суспензии бактериальных клеток (количество зависит от копийности и длины плазмиды).

Выделение производится согласно одному из трех вариантов протоколов в зависимости от используемого набора реагентов.

Протокол 1. Выделение плазмидной ДНК из 1-5 мл суспензии бактериальных клеток в пробирках 1.5 мл. Кат. номер PP-50-mini.

1) Подготовка и лизис образцов.

1. Осадить бактериальные клетки из культуральной среды центрифугированием, 1 мин, 12000 rcf либо использовать принятый в лаборатории протокол для осаждения бактериальных клеток. Удалить супернатант.
2. К осадку клеток добавить 200 мкл буфера SB. Ресуспендировать осадок пипетированием.
3. Суспензию перенести в центрифужную микропробирку объемом 1.5 мл.
4. К суспензии клеток добавить 2 мкл РНКазы A (10 мг/мл) и 200 мкл буфера для лизиса LB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси. Не использовать вортекс!
   Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.
   Примечание: Буфер для лизиса LB содержит pH-индикатор синего цвета.
5. Инкубировать полученную смесь не более 3 мин.
6. Добавить 200 мкл буфера для нейтрализации NB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси.
   Примечание: не использовать вортекс!
   Примечание: перемешать суспензию сразу после добавления буфера NB, чтобы избежать образования крупных частиц. Перемешивать суспензию до полного исчезновения частиц синего цвета.
7. Инкубировать 5 минут.
8. Центрифугировать 15 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.

2) Осаждение плазмидной ДНК.

1. Отобрать супернатант и перенести его в чистую микропробирку 1.5 мл.
   Примечание: если не все частицы осели на дно после центрифугирования, аккуратно перенести супернатант в чистую пробирку, избегая захвата осадка.
2. Добавить 420 мкл буфера для осаждения PS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5 раз.
3. Центрифугировать 15 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
4. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
   Примечание: осадок может быть прозрачным и незаметным на дне пробирки.

3) Промывка осадка.

1. К осадку добавить 500 мкл буфера для промывки WS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 2 раза.
   Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WS этанол.
2. Центрифугировать 5 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
3. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.

4) Растворение осадка ДНК.

1. Открыть крышку пробирки и подсушить осадок в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
2. К осадку добавить 45-60 мкл буфера для растворения ДНК DB. Убедитесь, что буфер DB полностью омывает дно пробирки. Допускаются аккуратные переворачивания или слабое кратковременное вортексирование.
3. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре.
4. Центрифугировать 1 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.
5. Аккуратно отобрать супернатант, не задевая осадок. Перенести в чистую микропробирку.
   Примечание: Буфер для растворения ДНК – 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Растворить образец также можно TE буфером (0.01 М Tris•HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
6. Раствор, содержащий ДНК, хранить при -20°C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.
   Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.

Протокол 2. Выделение плазмидной ДНК из 5-50 мл суспензии бактериальных клеток в пробирках 15 мл. Кат. номер PP-20-midi.

1) Подготовка и лизис образцов.

1. Осадить бактериальные клетки из культуральной среды центрифугированием, 1 мин, 12000 rcf либо использовать принятый в лаборатории протокол для осаждения бактериальных клеток. Удалить супернатант.
2. К осадку клеток добавить 2 мл буфера SB. Ресуспендировать осадок пипетированием.
3. Суспензию перенести в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. К суспензии клеток добавить 20 мкл РНКазы A (10 мг/мл) и 2 мл буфера для лизиса LB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси. Не использовать вортекс!
   Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.
   Примечание: Буфер для лизиса LB содержит pH-индикатор синего цвета.
5. Инкубировать полученную смесь не более 3 мин.
6. Добавить 2 мл буфера для нейтрализации NB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси.
   Примечание: не использовать вортекс!
   Примечание: перемешать суспензию сразу после добавления буфера NB, чтобы избежать образования крупных частиц. Перемешивать суспензию до полного исчезновения частиц синего цвета.
7. Инкубировать 5 минут.
8. Центрифугировать 20 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.

2) Осаждение плазмидной ДНК.

1. Отобрать супернатант и перенести его в чистую центрифужную пробирку 15 мл.
   Примечание: если не все частицы осели на дно после центрифугирования, аккуратно перенести супернатант в чистую пробирку, избегая захвата осадка.
2. Добавить 4,2 мл буфера для осаждения PS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5 раз.
3. Центрифугировать 15 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
4. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
   Примечание: осадок может быть прозрачным и незаметным на дне пробирки.

3) Промывка осадка.

1. К осадку добавить 2 мл буфера для промывки WS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 2 раза.
   Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WS этанол.
2. Центрифугировать 5 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
3. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.

4) Растворение осадка ДНК.

1. Открыть крышку пробирки и подсушить осадок в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
2. К осадку добавить 100-200 мкл буфера для растворения ДНК DB. Убедитесь, что буфер DB полностью омывает дно пробирки. Допускаются аккуратные переворачивания или слабое кратковременное вортексирование.
3. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре.
4. Центрифугировать 1 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.
5. Аккуратно отобрать супернатант, не задевая осадок. Перенести в чистую микропробирку.
   Примечание: Буфер для растворения ДНК – 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Растворить образец также можно TE буфером (0.01 М Tris•HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
6. Раствор, содержащий ДНК, хранить при -20°C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.
   Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.

Протокол 3. Выделение плазмидной ДНК из 50-100 мл суспензии бактериальных клеток в пробирках 50 мл. Кат. номер PP-12-maxi.

1) Подготовка и лизис образцов.

1. Осадить бактериальные клетки из культуральной среды центрифугированием, 1 мин, 12000 rcf либо использовать принятый в лаборатории протокол для осаждения бактериальных клеток. Удалить супернатант.
2. К осадку клеток добавить 7.5 мл буфера SB. Ресуспендировать осадок пипетированием.
3. Суспензию перенести в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
4. К суспензии клеток добавить 50 мкл РНКазы A (10 мг/мл) и 7.5 мл буфера для лизиса LB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси. Не использовать вортекс!
   Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.
   Примечание: Буфер для лизиса LB содержит pH-индикатор синего цвета.
5. Инкубировать полученную смесь не более 3 мин.
6. Добавить 7.5 мл буфера для нейтрализации NB. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5-10 раз до получения однородной смеси.
   Примечание: не использовать вортекс!
   Примечание: перемешать суспензию сразу после добавления буфера NB, чтобы избежать образования крупных частиц. Перемешивать суспензию до полного исчезновения частиц синего цвета.
7. Инкубировать 5 минут.
8. Центрифугировать 20 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.

2) Осаждение плазмидной ДНК.

1. Отобрать супернатант и перенести его в чистую центрифужную пробирку 50 мл.
   Примечание: если не все частицы осели на дно после центрифугирования, аккуратно перенести супернатант в чистую пробирку, избегая захвата осадка.
2. Добавить 15 мл буфера для осаждения PS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 5 раз.
3. Центрифугировать 15 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
4. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
   Примечание: осадок может быть прозрачным и незаметным на дне пробирки.

3) Промывка осадка.

1. К осадку добавить 7 мл буфера для промывки WS. Аккуратно перемешать вручную, переворачивая пробирку 2 раза.
   Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WS этанол.
2. Центрифугировать 5 мин, 12000 rcf при +4°C.
   Важно! Аккуратно достать пробирки из центрифуги, избегая переворачиваний и встряхиваний, чтобы избежать отслоения осадка ДНК и его последующего удаления.
3. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
4. Открыть крышку пробирки и подсушить осадок в течение 10-15 мин при комнатной температуре.

4) Растворение осадка ДНК.

1. Открыть крышку пробирки и подсушить осадок в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
2. К осадку добавить 0.8-1 мл буфера для растворения ДНК DB и омыть стенки дна пробирки 3-5 раз. Допускается слабое кратковременное вортексирование.
3. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре.
4. Центрифугировать 1 мин, 12000 rcf при комнатной температуре.
5. Аккуратно отобрать супернатант, не задевая осадок. Перенести в чистую микропробирку.
   Примечание: Буфер для растворения ДНК – 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Растворить образец также можно TE буфером (0.01 М Tris•HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) либо водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
6. Раствор, содержащий ДНК, хранить при -20°C. Для длительного хранения рекомендуется добавить EDTA (pH 8) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.
   Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.

Анализ выделенной ДНК

Целостность выделенной ДНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле.

Количество выделенной ДНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии.

Характерный максимум поглощения для ДНК при λ = 260 нм.

Посчитать концентрацию ДНК (мкг/мл) можно по следующей формуле:
A₂₆₀ * разбавление * 50 мкг/мл.

Характерные соотношения оптической плотности A₂₆₀/A₂₈₀ ~1.7-2.0.

Дополнительные реагенты:

В каталоге ООО «Биолабмикс» представлены реагенты для проведения агарозного гель-электрофореза.

• Буферы для электрофореза в агарозном геле: трис-ацетатный буфер (Кат. № BE-DNA-500, BE-DNA-1000), трис-боратный буфер (Кат. № TBE-500).
• Раствор бромистого этидия (Кат. № EtBr-10) для визуализации НК.
• Буферы для внесения образцов ДНК и РНК в гель (Кат. № D-3001, D-3002, D-3003).
• РНКаза A (Кат. № ER-500).
• Раствор Tris-HCl, 1 М, pH 7.5 (Кат. № Tris-100-7.5).
• Раствор Tris-HCl, 1 М, pH 8.5 (Кат. № Tris-100-8.5).
• Раствор EDTA, 0.5 М, pH 8 (Кат. № EDTA-10).

Условия хранения:

Набор для выделения ДНК хранить при температуре от +15 до +25 °C. Раствор РНКазы A хранить при температуре от -18 до -24°C. Срок годности см. на упаковке.

Важно! Закрыть бутыль, содержащую буфер LB, сразу после использования, чтобы избежать подкисления при попадании CO2 из воздуха.

Условия транспортировки:

Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.

Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение 14 суток.