
Доставка
Возврата
Поддержка
- Самовывоз - бесплатно;
- Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
(Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)
Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):
- при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
- при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;
Подробнее о доставке.
Набор реагентов БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ (2×) содержит 2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ, содержащий все необходимые компоненты (за исключением РНК матрицы и праймеров); БиоМастер-микс и Воду, обработанную ДЭПК. Набор предназначен для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ) с флуоресцентными зондами одношаговым методом.
В состав БиоМастер-микс входит M-MuLV –RH и HS-Taq ДНК-полимераза в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций.
M-MuLV –RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Фермент проявляет РНК- и ДНКзависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. Ревертаза M-MuLV –RH обладает повышенной термостойкостью и проявляет активность до 50°С.
HS-Taq ДНК-полимераза, представляет собой рекомбинантную Taq ДНКполимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами.
HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре до 70°С. Активация осуществляется на первом цикле ПЦР при короткой 5-и минутной инкубации при 95°С. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’-3’ экзонуклеазной активностью нативной Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus. Рекомбинантная HS-Taq ДНКполимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.о.
2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ оптимизирован для эффективного протекания как ОТ, так и ПЦР.
Состав набора
Каталожный номер | 2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ | 25× БиоМастермикс | ДМСО | Вода, обработанная ДЭПК | Кол-во реакций по 25 мкл |
RM03-80 | 2 × 0,5 мл | 1 × 80 мкл | 0,2 мл | 2 × 0,5 мл | 80 |
RM03-400 | 4 × 1,25 мл | 1 ×400 мкл | 0,5 мл | 3 × 1,8 мл | 400 |
Состав 2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ:
100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при 25 °C), 150 мM KCl, 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 8 мМ MgCl2, 8 мМ ДТТ, стабилизаторы и усилители ферментов.
Состав 25× БиоМастер-микс:
50 мМ Трис-HCl, pH 8.0 (при 25 °C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0.1 % (v/v) NP-40, ингибитор РНКаз, M-MuLV –RH ревертаза и HS-Taq ДНК-полимераза.
Применение
- Анализ экспрессии генов
- Одношаговая ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Свойства реакционной смеси
- Смесь оптимизирована для специфичной и эффективной работы M-MuLV –RH ревертазы и HS-Taq ДНК-полимеразы,
- Обеспечивает длительное хранение (хранение БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ (2×) в течение 2 дней при комнатной температуре и многократное замораживание - размораживание не снижает эффективность ОТ-ПЦР)
- Смесь не содержит красители, что делает её универсальной.
Преимущества использования
- Высокая специфичность;
- Высокая чувствительность;
- Простота и удобство в использовании;
- Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации;
- Позволяет стандартизовать условия постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах);
- Возможность ТА клонирования продуктов ПЦР за счет выступающих на концах амплифицированных фрагментов ДНК дезоксиаденозиновых остатков.
Ограничения к использованию
Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 т.п.о.
Протокол
Рекомендуем перед началом работ ознакомиться с правилами и рекомендациями, приведенными в описании к набору на сайте http://biolabmix.ru/catalog
- Разморозить 2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ и тщательно перемешать.
- Поместить тонкостенные пробирки для ПЦР в лед и добавить следующие компоненты из расчета объема одной реакционной смеси 25 мкл:
Компонент Объем Конечная концентрация 2× смесь для ОТ-ПЦР-РВ 12,5 мкл 1× 25× БиоМастер-микс 1 мкл Прямой праймер переменный 0,1 – 600 нМ Обратный праймер переменный 0,1 – 600 нМ Зонд переменный 0,1 – 300 нМ РНК-матрица переменный 1 пг – 1 мкг Стерильная вода до 25 мкл Примечание: в случае амплификации матриц, имеющих сложную пространственную структуру, допускается добавление ДМСО от 1 до 5% от конечного объема реакционной смеси. При этом учитывайте изменение Тm праймеров при составлении программы.
Примечание: в зависимости от копийности и сложности гена добавляемый объем БиоМастер-микс может варьироваться от 0,5 до 2 мкл на реакцию объемом 25 мкл.
- Осторожно перемешайте и сбросьте капли, используя центрифугу.
- Проведите ПЦР, используя один из рекомендованных режимов:
Шаг Температура, °С Время инкубации Количество циклов Обратная транскрипция 45 10-30 мин 1 Предварительная денатурация 95 5 мин 1 Денатурация 95 10-20 сек 30-50 Отжиг 50 – 68 (Tm-5) 10-20 сек Элонгация 72 0,5-1 мин/т.п.о. Либо:
Шаг Температура, °С Время инкубации Количество циклов Обратная транскрипция 45 10-30 мин 1 Предварительная денатурация 95 5 мин 1 Денатурация 95 15 сек 30-50 Отжиг/ Элонгация 50 – 68 1 мин - Результат проведения ПЦР отображается в виде кривых амплификации.
Оптимизация условий реакции
- В случае необходимости, объем реакции можно варьировать от 10 до 50 мкл, пропорционально изменяя количество всех компонентов.
- Для облегчения прохождения участков матрицы, содержащей GC-богатые участки и участки со сложной вторичной структурой, возможно увеличить температуру до 50°С и/или добавить реагенты, способствующие расплавлению вторичной структуры нуклеиновых кислот (например, ДМСО).
Условия хранения:
Хранить в месте, защищенном от попадания света: при +4 °С – 3 недели; при - 20°С – 1 год; не более 50 циклов замораживания-размораживания
Условия транспортировки:
Транспортировка в термоконтейнерах с охлаждающими элементами, допускается повышение температуры до температуры окружающей среды при транспортировке до 7 дней.
Вы смотрели
Комментарии (0)