Набор для проведения ПЦР с Фьюжн ДНК-полимеразой 250 мкл

Набор реагентов для постановки ПЦР с высокоточной Фьюжн ДНК-полимеразой. В набор входят отдельные компоненты такие как ионы магния, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) и диметилсульфоксид, что позволяет оптимизировать условия амплификации под задачи экспериментатора.

Состав набора

1. Рекомбинантная Фьюжн ДНК-полимераза, 2 е.а./мкл (слитая термостабильная ДНК-полимераза P. furiosus (Pfu) и ДНК-связывающий белок S. solfataricus (Sso7d)). Фермент находится в буфере следующего состава: 20 мМ Tris-HCl (рН 7,5 при 25°C), 100 мМ KCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл БСА, 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 50% глицерин.
2. 5х реакционный буфер, состав буфера: 250 мМ Tris-HCl (рН 9,0 при 25°C), 175 мМ KCl, 50 мМ (NH4)2SO4, 500 мМ трегалоза, 500 мкг/мл БСА, 0,5% Tween 20, 5% глицерин.
3. 50х смесь dNTP (по 10 мМ каждого).
4. 100 мМ раствор MgCl2.
5. 100% диметилсульфоксид (ДМСО).
6. Вода, обработанная диэтилпирокарбонатом свободная от нуклеаз.

* одна единица активности соответствует количеству фермента, необходимому для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию ДНК за 30 мин при 74°С.

Область применения

Фьюжн ДНК-полимераза обладает повышенной точностью копирования и синтезирует ампликоны с тупыми концами, поэтому набор является хорошим выбором для рутинного клонирования генов и может использоваться для получения методом ПЦР длинных или сложных ампликонов.

Протокол проведения стандартной реакции ПЦР с Фьюжн ДНК-полимеразой

1. Предварительно разморозьте компоненты набора и перемешайте растворы.
2. Смешайте индивидуальные компоненты в пробирке согласно таблице (для оптимального результата при замешивании реакционной смеси держите компоненты и реакционную смесь во льду):
   

   Компонент	Реакционная смесь, 25 мкл	Реакционная смесь, 50 мкл	Конечная концентрация
   5х реакционный буфер	5 мкл	10 мкл	1×
   50х смесь dNTP (по 10 мМ каждый)	0,5 мкл	1 мкл по	200 мкМ каждого dNTP
   100 мМ раствор MgCl2	переменный объем		2-5 мМ1
   ДМСО (100%)	переменный объем		до 10% (по объему)2
   Прямой праймер	переменный объем		100-500 нМ
   Обратный праймер	переменный объем		100-500 нМ
   Образец ДНК	переменный объем		от 1 пг до 250 нг
   Фьюжн ДНК-полимераза, 2 е.а./мкл	0,5 мкл	1 мкл	2,0 е.а. /50 мкл реакц. смеси
   Вода без нуклеаз	до 25 мкл	до 50 мкл	-

   ¹ В большинстве случаев мы рекомендуем использовать концентрацию ионов магния в диапазоне 3-4 мМ.

   ² Диметилсульфоксид рекомендуется добавлять в случае использования сложных, GCбогатых матриц, в большинстве случаев достаточно добавки до 5%, но иногда требуется оптимизация. Следует помнить, что добавка ДМСО снижает температуру плавления праймеров, 5% снижает примерно на 2,5°С.

3. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и «сбросьте капли» с помощью непродолжительного центрифугирования.
   Примечание: в случае использования амплификатора без греющейся крышки, добавьте в каждую пробирку каплю (25-35 мкл) минерального масла.
4. Перенесите пробирку с реакционной смесью в предварительно нагретый амплификатор (95-98°С).
5. Используйте следующую программу для стандартной ПЦР:
   

   Стадия	Температура и время	Количество циклов
   Предварительная денатурация	96-98°С, 30-120 сек	1 цикл
   Денатурация	96°С, 5-10 сек	25-35 циклов
   Отжиг праймеров*	50-72°С, 10-30 сек
   Элонгация	72°С, 15-30 сек/1 т.п.н.
   Финальная элонгация	5-10 мин	1 цикл

   
   * при амплификация больших фрагментов (≥ 5 т.п.н.) рекомендуется пропускать данную стадию
6. Проанализируйте продукты ПЦР в агарозном геле. Образцы предварительно необходимо смешать с буфером для внесения образцов в гель (например, с D3002).

Условия хранения

Хранить при температуре –20°C.

Условия транспортировки

Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение трех суток