Набор для проведения ПЦР с HS-Taq 500 е.а.

Набор для проведения ПЦР с HS-Taq содержит рекомбинантную HS-Taq ДНКполимеразу и растворы всех необходимых компонентов для проведения стандартной ПЦР c “горячим стартом”, за исключением матрицы ДНК и праймеров.

В состав набора входят: раствор HS-Taq ДНК-полимеразы (5 ед. акт./мкл), 5× ПЦР буфер, 50 мМ MgCl2, 50× смесь dNTP и буфер для нанесения (6×). Все реагенты высокого качества и оптимизированы для проведения ПЦР.

HS-Taq ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную Taq ДНКполимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами. HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре до 70 °С. Это позволяет избежать образования неспецифических продуктов и праймер-димеров при низкой температуре на стадии замешивания ПЦР. Активация осуществляется на первом цикле при короткой 5-минутной инкубации при 95 °С. Рекомбинантная Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’- 3’ экзонуклеазной активностью нативной Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus. Скорость продвижения Taq ДНК-полимеразы зависит от сложности ДНК-матрицы и составляет примерно 2 т.п.о./мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНКполимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.о.

5× ПЦР буфер оптимизирован для проведения эффективной и воспроизводимой ПЦР (не содержит MgCl2). В состав буфера входят добавки, повышающие время полужизни и процессивность HS-Taq ДНК-полимеразы за счет повышения её стабильности во время ПЦР. Буфер химически стабилен, инертен и не меняет оптимальной температуры отжига праймеров или характеристики плавления матрицы. Входящие в набор 50 мМ раствор MgCl2 и 50× смесь dNTP позволяют легко оптимизировать реакционную смесь под конкретную систему матрицапраймеры, а 6× буфер для нанесения на гель облегчает пробоподготовку для анализа в геле и контроль над ходом электрофореза.

Состав набора

*За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 10 нмоль dNTP в кислотонерастворимый продукт за 30 мин при 74 °С. Условия реакции: 50 мМ Трис-HCl, pH 9,0 (при 25 °С), 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 200 мM dATP, 200 мM dCTP, 200 мM dGTP, 50 мM [3H] dTTP, 0,25 мг/мл активированной ДНК из тимуса теленка.

Буфер хранения

50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 (при 25 °С), 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 1% (v/v) Тритон Х-100.

5× ПЦР буфер

50 мM Трис-НCl, рН 8,5 (при 25 °С), 250 мM KCl, 0,5% (v/v) Tween 20, стабилизаторы Taq ДНК-полимеразы.

Область применения

• ПЦР с “горячим стартом”;
• высокопроизводительная ПЦР;
• обычная ПЦР с высокой воспроизводимостью;
• наработка ПЦР-продуктов для ТА-клонирования;
• ОТ-ПЦР

Ограничения к использованию

Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 т.п.о.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: ионные детергенты (дезоксихолат натрия, саркозил и додецилсульфат натрия (SDS) в концентрациях выше, чем 0,06, 0,02 и 0,01%, соответственно).

Инактивируется экстракцией смесью фенол/хлороформ.

Протокол выполнения амплификации

Приготовьте несколько параллельных реакций и минимизируйте возможную ошибку пипетирования. Приготовьте реакционную смесь ПЦР смешав воду, буфер, смесь dNTP, праймеры и HS-Taq ДНК-полимеразу. Приготовьте реакционную смесь в расчёте на количество реакций плюс одна. Аликвотируйте реакционную смесь ПЦР в индивидуальные ПЦР пробирки и затем добавьте ДНК-матрицу.

1. Разморозить реакционную смесь и осторожно перемешать.
   Примечание: в случае формирования осадка нагреть пробирку до 50 °C и перемешать до полного его растворения.
2. В тонкостенные пробирки для ПЦР добавить следующие компоненты из расчета объема одной реакционной смеси 50 мкл:
   

   Компонент	Объем	Конечная концентрация
   5× ПЦР буфер	10 мкл	1×
   50× смесь dNTP	1 мкл	0,2 мМ каждого
   50 мМ MgCl2	переменный	1-5 мМ
   Прямой праймер	переменный	0,1-500 нМ
   Обратный праймер	переменный	0,1-500 нМ
   ДНК-матрица	переменный	10 пг – 1 мкг
   HS-Taq DNA-полимераза, 5 ед. акт./мкл	переменный	1-5 ед. акт
   Стерильная вода	До 50 мкл

3. Осторожно перемешать и сбросить капли, используя центрифугу.
   Примечание: в случае использования амплификатора без греющейся крышки добавить в каждую пробирку каплю (25-35 мкл) минерального масла.
4. Провести ПЦР, используя рекомендованные ниже температурные условия:
   

   Шаг	Температура, °С	Время инкубации	Количество циклов
   Предварительная денатурация	95	5 мин	1
   Денатурация	95	5-10 сек	25-50
   Отжиг	50-68 (Tm-5)	10-20 сек
   Элонгация	72	1,5-2 мин/т.п.о.
   Финальная элонгация	72	5-15 мин	1

   
   

   Tm - температура плавления дуплекса матрица/праймер определяется структурой праймеров. Для приблизительного расчета Tm можно воспользоваться формулой: Tm (°C) = 2 х (A+T) + 4 х (G+C).

5. После проведения ПЦР проанализировать продукты амплификации электрофорезом. Пробы смешиваются с буфером для нанесения и наносятся на гель.
   Примечание: для разделения продуктов реакции электрофорезом мы рекомендуем использовать 1х TАЕ буфер с бромистым этидием.
   Примечание: Подвижность красителей в 0,5–1,5% агарозном геле Ксилен цианол Бромфеноловый синий Orange G Тартразин 10000-4000 п.о. 500-400 п.о. <100 п.о. <20 п.о.

Условия хранения

Хранить в месте, защищенном от попадания света: при +25 °С - 7дней; при +4 °С - 4 месяца; при -20 °С - 18 месяцев; не более 50 циклов замораживания-размораживания.

Условия транспортировки

Транспортируется в термоконтейнерах с охлаждающими элементами, допускается повышение температуры до температуры окружающей среды при транспортировке до 10 дней.