Т4 ДНК Лигаза

Настоящий продукт является рекомбинантным ферментом, ДНК лигазой бактериофага Т4. Фермент имеет молекулярную массу 55,5 кДа. Т4 ДНК лигаза сшивает как «липкие» так и тупые концы с образованием фосфодиэфирной связи между соседними 5'-фосфатными и 3'-гидроксильными концами в двухцепочечных фрагментах ДНК или РНК. Фермент так же восстанавливает одноцепочечные разрывы в двухцепочечной ДНК. Для активности ферменту необходим кофермент АТФ. Оптимальную активность фермент проявляет при температуре 16°С.

Инактивации фермента происходи при 65°С в течение 10 минут.

Область применения

Клонирование рестрикционных фрагментов.

Соединение фрагментов ДНК с тупыми концами.

Источник

Т4 ДНК лигаза выделена из штамма E.coli, содержащего плазмиду с клонированным геном фермента бактериофага Т4.

Единицы активности

Одна единица активности соответствует количеству фермента, необходимому для сшивки 50% ДНК лямбда, гидролизованной HindIII (300 нг/мкл), в общем реакционном объеме 20 мкл за 30 минут при 16°C в стандартном реакционном буфере.

Концентрация фермента и фасовки: 200 е.а./мкл.

Буфер хранения

Фермент находится в растворе следующего состава: 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25°С), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA, 50% глицерин.

Контроль качества

Каждая партия фермента тестируется на специфическую активность фермента, электрофоретическую чистоту в SDS-ПААГ, отсутствие неспецифической нуклеазной активности.

Стандартный 1х буфер для проведения реакции: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5 при 25°С), 10 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ, 10 мМ DTT (500 мкл 10х буфера поставляется вместе с ферментом).

Типичные условия для проведения реакции

Для клонирования фрагментов ДНК смешайте в пробирке указанные компоненты:

• 2 мкл 10х стандартного реакционного буфера;
• 40-50 нг вектора (размером 4-5 т.п.н.);
• 30-40 нг вставки (размером 800-1000 п.н.);
• до 18 мкл воды, очищенной от нуклеаз;
• 2 мкл (400 е. а.) Т4 ДНК лигазы.

Инкубируйте реакционную смесь при 16°С в течение ночи.

Условия хранения и транспортировки

Хранить при температуре –20°С.

Допускается транспортирование при температуре не выше +8°C в течение трех суток.