ДНКаза (термолабильная) 2500 е.а.

Фермент проявляет высокую специфическую активность в отношении двухцепочечной ДНК, при этом одноцепочечные ДНК или РНК остаются неповрежденными в стандартных условиях. При гидролизе фосфодиэфирнойсвязи образует 5’-фосфатная и 3’-гидроксильная группы.

ДНКазу легко инактивировать при 55°C. Фермент предназначен для приложений, в которых требуется отсутствие дцДНК, для быстрой очистки образцов РНК и белков от примеси ДНК, разрушения ДНК-матрицы в реакциях транскрипции. Активность по отношению к дцДНК выше в 1000 раз и более, чем к оцДНК.

Состав

Определение единицы активности

Одна единица активности фермента определена как увеличение поглощения при 260 нм на 1.0 при 37 °C, 30 мин в 50 мМ Tris-HCl буфере (pH 8.0 при 25°C), содержащим 5 мМ MgCl2, 0.1 мг/мл БСА и 0.5 мг/мл ДНК спермы сельди в качестве субстрата.

Буфер для хранения

ДНКаза поставляется в буфере со следующим составом:

20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂, 50 % (v/v) глицерин.

Буфер для реакции 10x

100 мМ Tris-HCl (pH 7), 30 мМ MgCl₂, 30 мМ CaCl₂

Эксплуатация

• Оптимальная конечная концентрация ДНКазы в реакционной смеси зависит от количества нуклеиновых кислот, температуры и времени инкубации.
• Для образца с высоким содержанием ДНК ( 1 мкг) рекомендуется использовать 1.0 ед ДНКазы при объёме реакционной смеси 20 мкл и инкубации 37 °C, 30 мин.
• При необходимости возможна инкубация при 25 °C. Например, если требуется избежать частичной деградации РНК при нагреве.
• Важно! При удалении ДНК в образце РНК, если требуется избежать частичной деградации РНК, инкубацию с ДНКазой можно проводить при 25 °C.
• Важно! Не рекомендуется проводить температурную инактивацию, если требуется сохранить целостность РНК. В таком случае, следует провести очистку РНК от ДНКазы осаждением в этаноле либо с помощью сорбционных методов (центрифужные колонки или магнитные частицы).

• Процесс инактивация ДНКазы зависит от конечной концентрации восстанавливающих агентов, например (1-10 мМ TCEP или DTT), времени и температура.
• Для полной инактивации 1.0 ед ДНКазы в реакционной смеси объёмом 20 мкл добавить раствор 100 мМ TCEP или DTT до конечной концентрации 10 мМ. Инкубировать при 55°C, 15 мин.
• Важно! Реагенты TCEP или DTT могут ингибировать протекание ферментативных реакций, например, ПЦР. Степень ингибирования зависит от количества образца, конечной концентрации TCEP или DTT, типа и количества фермента. При использовании TCEP или DTT рекомендуется оценить конечную концентрацию данных реагентов, которая не приводит к значимому ингибированию последующей ферментативной реакции.
• Фермент не нужно удалять из раствора перед последующими процедурами, т.к. термическая обработка полностью и необратимо удаляет его активность.
• Важно! ДНКазу нельзя инактивировать инкубацией с EDTA. EDTA связывает ионы Mg2+ и Ca2+, которые нужны для работы фермента. Соответственно ДНКаза перестаёт работать. Но при внесении в раствор с ферментом дополнительных ионов Mg2+ и Ca2+ ДНКаза начинает работать. Такие ионы могут попасть в раствор, например, при смешивании с буфером для ПЦР.

Примеры № 1

• Для гидролиза 1 мкг ДНК, выделенной наборами реагентов компании ООО «Биолабмикс» (например, серии DU, D-Cells, D-Blood, D-Tissues, D-Plants) достаточно 1-2 ед ДНКазы при объёме реакционной смеси 20-30 мкл.
• Важно! Избыток ДНКазы не мешает проведению реакции.

Для примера рассмотрим раствор ДНК с концентрацией 50 нг/мкл.

Обработка образца ДНК ДНКазой

Инкубировать при 37 °C, 30 мин.

Инактивация ДНКазы

Добавить 2.5 мкл раствора 100 мМ TCEP или 100 мМ DTT до конечной концентрации ~ 10 мМ.

Инкубировать при 55 °C, 15 мин.

Примечание: растворы 100 мМ TCEP или DTT не входят в комплектацию поставки реагента.

Примеры № 2

• Для гидролиза примеси ДНК, которая содержится при выделении 1 мкг РНК наборами реагентов компании ООО «Биолабмикс» (например, серии LR, LRP, LRU, RUplus, R-Plants), достаточно 0.1-0.2 ед ДНКазы при объёме реакционной смеси 20-30 мкл.
• Для удобства работы с ДНКазой в количестве 0.1-0.2 ед разбавить необходимый для проведения реакции объём ДНКазы в 10 раз водой тип I до концентрации 0.2 ед/мкл.

Важно! Избыток ДНКазы не мешает проведению реакции.

Примечание: не хранить разбавленный раствор ДНКазы.

Для примера рассмотрим раствор РНК с концентрацией 100 нг/мкл.

Обработка образца РНК ДНКазой

Инкубировать при 37 °C, 30 мин.

p>Примечание: при нагреве возможна частичная деградация РНК. Инкубацию возможно провести при 25 °C.

Инактивация ДНКазы

Добавить 2.5 мкл раствора 10 мМ TCEP или 10 мМ DTT до конечной концентрации ~ 1 мМ.

Инкубировать при 55 °C, 15 мин.

Примечание: растворы 10, 100 мМ TCEP или DTT не входят в комплектацию поставки реагента.

Примечание: при нагреве возможна частичная деградация РНК. Если важно сохранить целостность РНК, то не рекомендуется проводить инактивацию ДНКазы. В таком случае провести очистку РНК от ДНКазы осаждением в этаноле либо с помощью сорбционных методов (центрифужные колонки или магнитные частицы).

Примечание: В каталоге ООО «Биолабмикс» представлен Набор для выделения ДНК и РНК из реакционных смесей (Кат. № DR-10, DR-50, DR-250), который может быть использован для очистки РНК от ДНКазы на центрифужных колонках.

Объём РНК после выделения от 60 мкл. Выход РНК 70-80%.

Условия хранения:

Хранить при температуре -20°С. Срок годности см. на упаковке.

Для долгосрочного хранения хранить при – 80°C. Фермент не теряет свою активность после не менее 15 циклов заморозки и оттаивания.

Условия транспортировки:

Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.

Допускается транспортирование при температуре не выше +25°C в течение 14 суток.