• Напишите нам
  • mail@snablab.ru
+7(495)660-35-58 Перезвоните мне
Пн. - Чт.: с 9.00 до 18.00
Пт.: с 9.00 до 17.00

Набор для проведения T7-транскрипции in vitro 100 реакций

Наличие товара: Под заказ
Бесплатная
Доставка
Гарантия
Возврата
Онлайн
Поддержка
i
  • Самовывоз - бесплатно;
  • Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
    (Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)

Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):

  • при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
  • при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;

Подробнее о доставке.

Цена по запросу

Набор для проведения T7-транскрипции in vitro (T7-tr-20, T7-tr-100) предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro. Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7 (Рисунок 1).

Полученная в результате транскрипции РНК может быть использована для изучения структуры и функций РНК, для исследования механизмов РНК-интерференции, для систем геномного редактирования в качестве направляющей РНК, для трансфекции клеток в присутствии трансфицирующих агентов, для трансляции in vitro и др.

Рисунок 1. Синтез РНК транскрипта на ДНК матрице с помощью T7 РНК-полимеразы.

Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:

5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAGNN…–3'.

Первое основание, включаемое в РНК: G;

следующие NN: идеально CG.

Примечание! Набор для проведения T7-транскрипции in vitro также позволяет включать в структуру РНК модифицированные нуклеотиды (природные (псевдоуридин, 5–метилцитидин, N6-метиладенозин); химически модифицированные (биотин–, флюоресцеин–, аминоалил–НТФ); аналоги кэпа (ARCA)).

Состав набора:

  T7-tr20 (20 реакций) T7-tr100 (100 реакций)
(×5) Буфер для T7-транскрипции 240 мкл 1,2 мл
(×25) ДТТ 50 мкл 250 мкл
T7 РНК-полимераза 25 мкл 125 мкл
Смесь рНТФ 45 мкл 230 мкл
Стерильная вода 1 мл 4 мл

(×5) Буфер для T7-транскрипции

Буфер на основе Трис, соли и другие компоненты

(×25) ДТТ

250 мМ ДТТ

Стерильная вода

T7 РНК-полимераза

150 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин

Смесь рНТФ

25 мМ каждого rNTP (rATP, rUTP, rCTP, rGTP)

Материалы и оборудование необходимые для работы

  • Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
  • Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
  • Микроцентрифуга.

Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза РНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с РНК.

Сопутствующая продукция

  • ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
  • Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
  • Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс).
  • 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс).
  • Аналог кэпа ARCA (ARCA-0050, Биолабмикс).
  • Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
  • Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).

Протокол T7-транскрипции in vitro

1. Подготовка реакционной смеси

Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:

Компонент Коонцентрация Финальная конц. Объем
(×5) Буфер для T7-транскрипции (×5) (×1) 10 мкл
(×25) ДТТ (×25) (×1) 2 мкл
Смесь рНТФ 25 мМ каждого rNTP 1 мМ каждого rNTP 2 мкл
T7 РНК-полимераза 150 е.а./мкл 3 е.а./мкл 1 мкл
ДНК матрица вариабельная вариабельная 0.5–2 мкг
Стерильная вода   до 50 мкл
Общий объем реакции   50 мкл

2. Инкубация

Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.

3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК матрицы

Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК матрица не мешает в последующих экспериментах.

Примечание! Протокол синтеза РНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК матрицы; конечной концентрации каждого rNTP 1 мМ.

Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 10–30 мкг РНК с 1 мкг ДНК матрицы после 2-х часов инкубации (РНК транскрипт 1.2 т.н.). Количество получаемой РНК может варьироваться в зависимости от ДНК матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).

Индивидуальная оптимизация протокола

В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК матрицу перед постановкой реакции транскрипции.

При работе с короткими ДНК матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).

Анализ синтезированной РНК

Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro РНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле.

Очистить РНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.

Количество очищенной РНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A260 × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A260/A280 ≥ 1.8-2.0, A260/230 ≥ 1.9.

Условия хранения:

Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев.

Вы смотрели