
Доставка
Возврата
Поддержка
- Самовывоз - бесплатно;
- Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
(Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)
Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):
- при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
- при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;
Подробнее о доставке.
Набор для проведения T7-транскрипции in vitro (T7-tr-20, T7-tr-100) предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro. Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7 (Рисунок 1).
Полученная в результате транскрипции РНК может быть использована для изучения структуры и функций РНК, для исследования механизмов РНК-интерференции, для систем геномного редактирования в качестве направляющей РНК, для трансфекции клеток в присутствии трансфицирующих агентов, для трансляции in vitro и др.
Рисунок 1. Синтез РНК транскрипта на ДНК матрице с помощью T7 РНК-полимеразы.
Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:
5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAGNN…–3'.
Первое основание, включаемое в РНК: G;
следующие NN: идеально CG.
Примечание! Набор для проведения T7-транскрипции in vitro также позволяет включать в структуру РНК модифицированные нуклеотиды (природные (псевдоуридин, 5–метилцитидин, N6-метиладенозин); химически модифицированные (биотин–, флюоресцеин–, аминоалил–НТФ); аналоги кэпа (ARCA)).
Состав набора:
T7-tr20 (20 реакций) | T7-tr100 (100 реакций) | |
(×5) Буфер для T7-транскрипции | 240 мкл | 1,2 мл |
(×25) ДТТ | 50 мкл | 250 мкл |
T7 РНК-полимераза | 25 мкл | 125 мкл |
Смесь рНТФ | 45 мкл | 230 мкл |
Стерильная вода | 1 мл | 4 мл |
(×5) Буфер для T7-транскрипции
Буфер на основе Трис, соли и другие компоненты
(×25) ДТТ
250 мМ ДТТ
Стерильная вода
T7 РНК-полимераза
150 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин
Смесь рНТФ
25 мМ каждого rNTP (rATP, rUTP, rCTP, rGTP)
Материалы и оборудование необходимые для работы
- Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
- Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
- Микроцентрифуга.
Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза РНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с РНК.
Сопутствующая продукция
- ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
- Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
- Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс).
- 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс).
- Аналог кэпа ARCA (ARCA-0050, Биолабмикс).
- Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
- Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).
Протокол T7-транскрипции in vitro
1. Подготовка реакционной смеси
Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:
Компонент | Коонцентрация | Финальная конц. | Объем |
(×5) Буфер для T7-транскрипции | (×5) | (×1) | 10 мкл |
(×25) ДТТ | (×25) | (×1) | 2 мкл |
Смесь рНТФ | 25 мМ каждого rNTP | 1 мМ каждого rNTP | 2 мкл |
T7 РНК-полимераза | 150 е.а./мкл | 3 е.а./мкл | 1 мкл |
ДНК матрица | вариабельная | вариабельная | 0.5–2 мкг |
Стерильная вода | до 50 мкл | ||
Общий объем реакции | 50 мкл |
2. Инкубация
Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.
3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК матрицы
Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК матрица не мешает в последующих экспериментах.
Примечание! Протокол синтеза РНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК матрицы; конечной концентрации каждого rNTP 1 мМ.
Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 10–30 мкг РНК с 1 мкг ДНК матрицы после 2-х часов инкубации (РНК транскрипт 1.2 т.н.). Количество получаемой РНК может варьироваться в зависимости от ДНК матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).
Индивидуальная оптимизация протокола
В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК матрицу перед постановкой реакции транскрипции.
При работе с короткими ДНК матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).
Анализ синтезированной РНК
Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro РНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле.
Очистить РНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.
Количество очищенной РНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A260 × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A260/A280 ≥ 1.8-2.0, A260/230 ≥ 1.9.
Условия хранения:
Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев.
Вы смотрели
Комментарии (0)