• Напишите нам
  • mail@snablab.ru
+7(495)660-35-58 Перезвоните мне
Пн. - Чт.: с 9.00 до 18.00
Пт.: с 9.00 до 17.00

Набор для синтеза мРНК in vitro (с m7GmAmG)

Наличие товара: Под заказ
Бесплатная
Доставка
Гарантия
Возврата
Онлайн
Поддержка
i
  • Самовывоз - бесплатно;
  • Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
    (Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)

Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):

  • при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
  • при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;

Подробнее о доставке.

Цена по запросу

Набор для синтеза мРНК in vitro (с m7GmAmG)Набор для синтеза мРНК in vitro (с m7GmAmG) предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro для получения Cap-1 кэпированной мРНК. Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК–матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7.

Молекулярная структура аналога кэпа m7GmAmG

Функциональные мРНК должны содержать следующие элементы: кэп на 5'-конце, 5'-UTR, правильно ориентированная кодирующая последовательность, 3'-UTR, поли(А)-хвост на 3'-конце. Благодаря тому, что включение аналога кэпа m7GmAmG в структуру мРНК возможно только в правильной ориентации, кэпированные мРНК обладают 100% трансляционной активностью. Более того, постановка реакции транскрипции с использованием тринуклеотидного аналога кэпа m7GmAmG предотвращает потерю в выходе РНК-транскрипта, характерную для протоколов с применением аналога кэпа ARCA.

Полученная в результате транскрипции мРНК может быть использована для изучения функций мРНК, для микроинъекций, для трансфекции клеток, для трансляции in vitro и др.

Синтез РНК–транскрипта на ДНК–матрице с помощью T7 РНК-полимеразы

Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:

5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAAGN…–3'.

Первые основания, включаемые в РНК: AG.

Примечание! Использование ДНК–матрицы, кодирующей поли(А)-хвост на 3'- конце транскрипта, позволяет получить Cap-1 кэпированную полиаденилированную мРНК в ходе одной 2-х часовой реакции. Альтернативный путь полиаденилирования мРНК: пост-транскрипционное добавление поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы.

Состав набора:

Компонент AG-mRNA-20 (20 реакций)
(×5) Буфер для синтеза мРНК 240 мкл
(×10) ДТТ 120 мкл
T7 РНК-полимераза 70 мкл
ATP 120 мкл
UTP 120 мкл
CTP 120 мкл
GTP 120 мкл
m7GmAmG 120 мкл
Стерильная вода 1 мл

(×5) Буфер для синтеза мРНК

Буфер на основе HEPES, соли и другие компоненты

(×10) ДТТ

100 мМ ДТТ

Стерильная вода

T7 РНК-полимераза

300 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин

ATP, UTP, CTP, GTP

30 мМ каждого NTP

m7GmAmG

30 мМ m7GmAmG

Материалы и оборудование, необходимые для работы:

  • Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
  • Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
  • Микроцентрифуга.

Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза мРНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с мРНК.

Сопутствующая продукция

  • ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
  • Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
  • Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс).
  • 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс).
  • Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
  • Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).

Протокол синтеза мРНК

1. Подготовка реакционной смеси

Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:

Компонент Концентрация Финальная концентрация Объем
(×5) Буфер для синтеза мРНК (×5) (×1) 10 мкл
(×10) ДТТ (×10) (×1) 5 мкл
ATP 30 мМ 3 мМ 5 мкл
UTP 30 мМ 3 мМ 5 мкл
CTP 30 мМ 3 мМ 5 мкл
GTP 30 мМ 3 мМ 5 мкл
m7GmAmG 30 мМ 2.4 мМ 4 мкл
T7 РНК-полимераза 300 е.а./мкл 18 е.а./мкл 3 мкл
ДНК–матрица вариабельная вариабельная 0.5–2 мкг
Стерильная вода   до 50 мкл
Общий объем реакции   50 мкл

2. Инкубация

Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.

3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК–матрицы

Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК–матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК–матрица не мешает в последующих экспериментах.

Примечание! Протокол синтеза мРНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК–матрицы; конечной концентрации каждого NTP 3 мМ; соотношения m7GmAmG:GTP, равном 4:5.

Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 30–60 мкг Cap-1 кэпированной мРНК с 1 мкг ДНК–матрицы после 2-х часов инкубации. Количество получаемой мРНК может варьироваться в зависимости от ДНК–матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).

Индивидуальная оптимизация протокола синтеза мРНК

В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК–матрицу перед постановкой реакции транскрипции.

В зависимости от последовательности и конечного применения синтезируемой мРНК индивидуальная оптимизация отдельных этапов протокола может улучшить как выход реакции, так и биологическую функцию мРНК (например, изменение времени инкубации; изменение количества ДНК–матрицы; включение модифицированных нуклеотидов, таких как m5CTP или ΨTP).

При работе с короткими ДНК–матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).

Анализ синтезированной мРНК

Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro мРНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле. Очистить мРНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.

Количество очищенной мРНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A260 × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A260/A280 ≥ 1.8-2.0, A260/230 ≥ 1.9.

Условия хранения:

Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев

Вы смотрели