Доставка
Возврата
Поддержка
- Самовывоз - бесплатно;
- Отправка до Транпортной компании - бесплатно;
(Деловые линии, ЖелДорЭкспедиция, ПЭК, Nord Will, СДЭК)
Доставка до порога (без учета погрузо-разгрузочных работ) по Москве и МО (не более 15км от МКАД):
- при заказе от 20 000 руб - бесплатно;
- при заказе от 10 000 руб - от +1 500 руб;
Подробнее о доставке.
Набор для синтеза мРНК in vitro (с m7GmAmG)Набор для синтеза мРНК in vitro (с m7GmAmG) предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro для получения Cap-1 кэпированной мРНК. Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК–матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7.
Молекулярная структура аналога кэпа m7GmAmG
Функциональные мРНК должны содержать следующие элементы: кэп на 5'-конце, 5'-UTR, правильно ориентированная кодирующая последовательность, 3'-UTR, поли(А)-хвост на 3'-конце. Благодаря тому, что включение аналога кэпа m7GmAmG в структуру мРНК возможно только в правильной ориентации, кэпированные мРНК обладают 100% трансляционной активностью. Более того, постановка реакции транскрипции с использованием тринуклеотидного аналога кэпа m7GmAmG предотвращает потерю в выходе РНК-транскрипта, характерную для протоколов с применением аналога кэпа ARCA.
Полученная в результате транскрипции мРНК может быть использована для изучения функций мРНК, для микроинъекций, для трансфекции клеток, для трансляции in vitro и др.
Синтез РНК–транскрипта на ДНК–матрице с помощью T7 РНК-полимеразы
Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:
5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAAGN…–3'.
Первые основания, включаемые в РНК: AG.
Примечание! Использование ДНК–матрицы, кодирующей поли(А)-хвост на 3'- конце транскрипта, позволяет получить Cap-1 кэпированную полиаденилированную мРНК в ходе одной 2-х часовой реакции. Альтернативный путь полиаденилирования мРНК: пост-транскрипционное добавление поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы.
Состав набора:
Компонент | AG-mRNA-20 (20 реакций) |
(×5) Буфер для синтеза мРНК | 240 мкл |
(×10) ДТТ | 120 мкл |
T7 РНК-полимераза | 70 мкл |
ATP | 120 мкл |
UTP | 120 мкл |
CTP | 120 мкл |
GTP | 120 мкл |
m7GmAmG | 120 мкл |
Стерильная вода | 1 мл |
(×5) Буфер для синтеза мРНК
Буфер на основе HEPES, соли и другие компоненты
(×10) ДТТ
100 мМ ДТТ
Стерильная вода
T7 РНК-полимераза
300 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин
ATP, UTP, CTP, GTP
30 мМ каждого NTP
m7GmAmG
30 мМ m7GmAmG
Материалы и оборудование, необходимые для работы:
- Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
- Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
- Микроцентрифуга.
Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза мРНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с мРНК.
Сопутствующая продукция
- ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
- Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
- Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс).
- 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс).
- Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
- Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).
Протокол синтеза мРНК
1. Подготовка реакционной смеси
Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:
Компонент | Концентрация | Финальная концентрация | Объем |
(×5) Буфер для синтеза мРНК | (×5) | (×1) | 10 мкл |
(×10) ДТТ | (×10) | (×1) | 5 мкл |
ATP | 30 мМ | 3 мМ | 5 мкл |
UTP | 30 мМ | 3 мМ | 5 мкл |
CTP | 30 мМ | 3 мМ | 5 мкл |
GTP | 30 мМ | 3 мМ | 5 мкл |
m7GmAmG | 30 мМ | 2.4 мМ | 4 мкл |
T7 РНК-полимераза | 300 е.а./мкл | 18 е.а./мкл | 3 мкл |
ДНК–матрица | вариабельная | вариабельная | 0.5–2 мкг |
Стерильная вода | до 50 мкл | ||
Общий объем реакции | 50 мкл |
2. Инкубация
Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.
3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК–матрицы
Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК–матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК–матрица не мешает в последующих экспериментах.
Примечание! Протокол синтеза мРНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК–матрицы; конечной концентрации каждого NTP 3 мМ; соотношения m7GmAmG:GTP, равном 4:5.
Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 30–60 мкг Cap-1 кэпированной мРНК с 1 мкг ДНК–матрицы после 2-х часов инкубации. Количество получаемой мРНК может варьироваться в зависимости от ДНК–матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).
Индивидуальная оптимизация протокола синтеза мРНК
В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК–матрицу перед постановкой реакции транскрипции.
В зависимости от последовательности и конечного применения синтезируемой мРНК индивидуальная оптимизация отдельных этапов протокола может улучшить как выход реакции, так и биологическую функцию мРНК (например, изменение времени инкубации; изменение количества ДНК–матрицы; включение модифицированных нуклеотидов, таких как m5CTP или ΨTP).
При работе с короткими ДНК–матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).
Анализ синтезированной мРНК
Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro мРНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле. Очистить мРНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.
Количество очищенной мРНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A260 × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A260/A280 ≥ 1.8-2.0, A260/230 ≥ 1.9.
Условия хранения:
Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев
Вы смотрели
Комментарии ()