Набор для синтеза мРНК in vitro (с ΨTP и m5CTP с m7GmAmG)

Набор для синтеза мРНК in vitro (с ΨTP и m5CTP с m7GmAmG) предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro для получения Cap-1 кэпированной мРНК, содержащей в структуре модифицированные нуклеотиды: псевдоуридин (Ψ), 5-метилцитидин (m5C). Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК–матрице при помощи ДНКзависимой РНК-полимеразы бактериофага T7.

Молекулярная структура аналога кэпа m7GmAmG

Функциональные мРНК должны содержать следующие элементы: кэп на 5'-конце, 5'-UTR, правильно ориентированная кодирующая последовательность, 3'-UTR, поли(А)-хвост на 3'-конце. Благодаря тому, что включение аналога кэпа m7GmAmG в структуру мРНК возможно только в правильной ориентации, кэпированные мРНК обладают 100% трансляционной активностью. Более того, постановка реакции транскрипции с использованием тринуклеотидного аналога кэпа m7GmAmG предотвращает потерю в выходе РНК-транскрипта, характерную для протоколов с применением аналога кэпа ARCA. Наличие модифицированных нуклеотидов: псевдоуридина и 5-метилцитидина – повышает стабильность и снижает иммуногенность мРНК.

Полученная в результате транскрипции мРНК может быть использована для изучения функций мРНК, для микроинъекций, для трансфекции клеток, для трансляции in vitro и др.

Синтез РНК–транскрипта на ДНК–матрице с помощью T7 РНК-полимеразы

Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:

5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAAGN…–3'.

Первые основания, включаемые в РНК: AG.

Примечание! Использование ДНК–матрицы, кодирующей поли(А)-хвост на 3'-конце транскрипта, позволяет получить Cap-1 кэпированную полиаденилированную мРНК в ходе одной 2-х часовой реакции. Альтернативный путь полиаденилирования мРНК: пост-транскрипционное добавление поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы.

Состав набора:

(×5) Буфер для синтеза мРНК

Буфер на основе HEPES, соли и другие компоненты

(×10) ДТТ

100 мМ ДТТ

Стерильная вода

T7 РНК-полимераза

300 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин

ATP, ΨTP, m5CTP, GTP

30 мМ каждого NTP

m7GmAmG

30 мМ m7GmAmG

Материалы и оборудование, необходимые для работы:

• Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
• Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
• Микроцентрифуга.

Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза мРНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с мРНК.

Сопутствующая продукция

• ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
• Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
• Уридин-5'-трифосфат (UTP) (N-rU0100, Биолабмикс).
• Цитидин-5'-трифосфат (CTP) (N-rC0100, Биолабмикс).
• Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
• Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).

Протокол синтеза мРНК

1. Подготовка реакционной смеси

Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:

2. Инкубация

Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.

3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК–матрицы

Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК–матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК–матрица не мешает в последующих экспериментах.

Примечание! Протокол синтеза мРНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК–матрицы; конечной концентрации каждого NTP 3 мМ; соотношения m7GmAmG:GTP, равном 4:5; полной замены UTP и CTP на ΨTP и m5CTP, соответственно.

Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 30–60 мкг Cap-1-кэпированной мРНК с 1 мкг ДНК–матрицы после 2-х часов инкубации. Количество получаемой мРНК может варьироваться в зависимости от ДНК–матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).

Индивидуальная оптимизация протокола синтеза мРНК

В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК–матрицу перед постановкой реакции транскрипции.

В зависимости от последовательности и конечного применения синтезируемой мРНК индивидуальная оптимизация отдельных этапов протокола может улучшить как выход реакции, так и биологическую функцию мРНК (например, изменение времени инкубации; изменение количества ДНК–матрицы; регуляция соотношения UTP:ΨTP, CTP:m5CTP).

При работе с короткими ДНК–матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).

Анализ синтезированной мРНК

Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro мРНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле. Очистить мРНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.

Количество очищенной мРНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A₂₆₀ × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A₂₆₀/A₂₈₀ ≥ 1.8-2.0, A₂₆₀/₂₃₀ ≥ 1.9.

Условия хранения:

Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев