Набор для синтеза мРНК in vitro

Набор для синтеза мРНК in vitro предназначен для постановки реакции транскрипции in vitro для получения мРНК. Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК–матрице при помощи ДНКзависимой РНК-полимеразы бактериофага T7.

Полученная в результате транскрипции мРНК может быть использована для изучения функций мРНК, для микроинъекций, для трансфекции клеток, для трансляции in vitro и др.

Синтез РНК–транскрипта на ДНК–матрице с помощью T7 РНК-полимеразы.

Примечание! Минимальная последовательность промотора Т7:

5'–NNNNNNNTAATACGACTCACTATAGNN…–3'.

Первое основание, включаемое в РНК: G;

следующие NN: идеально CG.

Примечание! Использование ДНК–матрицы, кодирующей поли(А)-хвост на 3'- конце транскрипта, позволяет получить полиаденилированную мРНК в ходе одной 2-х часовой реакции. Альтернативный путь полиаденилирования мРНК: пост-транскрипционное добавление поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы.

Примечание! Набор для синтеза мРНК in vitro также позволяет включать в структуру РНК модифицированные нуклеотиды (природные (псевдоуридин, 5–метилцитидин, N6-метиладенозин); химически модифицированные (биотин–,флюоресцеин–, аминоалил–NTP); аналоги кэпа (ARCA)).

Состав набора:

(×5) Буфер для синтеза мРНК

Буфер на основе HEPES, соли и другие компоненты

(×10) ДТТ

100 мМ ДТТ

Стерильная вода

T7 РНК-полимераза

300 е.а./мкл в буфере для хранения, 50% (v/v) глицерин

ATP, UTP, CTP, GTP

30 мМ каждого NTP

Материалы и оборудование, необходимые для работы:

• Микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл.
• Термостат с возможностью поддержания температуры 37°С.
• Микроцентрифуга.

Примечание! Организация рабочего пространства и использование растворов, гарантирующие отсутствие РНКаз, имеет решающее значение для успешного синтеза мРНК. Рекомендуется использовать ингибитор РНКаз на этапах синтеза и последующей работы с мРНК.

Сопутствующая продукция

• ДНКаза (термолабильная) (EM-100, Биолабмикс).
• Ингибитор РНКаз (RI-0020, Биолабмикс).
• Псевдоуридин-5'-трифосфат (TPU-0050, Биолабмикс).
• 5-метилцитидин-5'-трифосфат (TMC-0050, Биолабмикс).
• Аналог кэпа ARCA (ARCA-0050, Биолабмикс).
• Буфер для нанесения образцов РНК на гель «ФриК» (D-3001, Биолабмикс).
• Набор для выделения РНК на колонках (RU-10, Биолабмикс).

Протокол синтеза мРНК

1. Подготовка реакционной смеси

Поместите T7 РНК-полимеразу на лед. Разморозьте при комнатной температуре остальные компоненты набора, перемешайте и сбросьте капли коротким центрифугированием. В микроцентрифужные пробирки на 0,6 или 1,5 мл добавьте следующие компоненты:

2. Инкубация

Тщательно перемешайте реакционную смесь пипетированием. Инкубируйте реакционную смесь при 37°С в течение 2-х часов.

3. Обработка ДНКазой для удаления ДНК–матрицы

Добавьте 2 е.а. ДНКазы I на 1 мкг ДНК–матрицы к реакционной смеси, перемешайте и инкубируйте при 37°C в течение 15 минут. Обработка ДНКазой необязательна, если ДНК–матрица не мешает в последующих экспериментах.

Примечание! Протокол синтеза мРНК оптимизирован для 0.5–2 мкг ДНК–матрицы; конечной концентрации каждого NTP 3 мМ.

Примечание! Реакция объемом 50 мкл дает выход около 30–60 мкг мРНК с 1 мкг ДНК–матрицы после 2-х часов инкубации. Количество получаемой мРНК может варьироваться в зависимости от ДНК–матрицы (дизайн промотора, длина последовательности, формирование вторичной структуры).

Индивидуальная оптимизация протокола синтеза мРНК

В качестве матрицы для транскрипции in vitro можно использовать как линеаризованную плазмидную ДНК, так и ПЦР-продукт, содержащие Т7 промотор со стороны 5'-конца последовательности, которая должна быть транскрибирована. В случае плазмиды, ДНК должна быть полностью линеаризована. Рекомендуется очищать ДНК–матрицу перед постановкой реакции транскрипции.

В зависимости от последовательности и конечного применения синтезируемой мРНК индивидуальная оптимизация отдельных этапов протокола может улучшить как выход реакции, так и биологическую функцию мРНК (например, изменение времени инкубации; изменение количества ДНК–матрицы).

При работе с короткими ДНК–матрицами (< 0.5 т.п.н.) рекомендуется увеличить время инкубации до 4-х часов. Безопасно инкубировать реакцию при 37°С в течение 16-и часов (ночь).

Анализ синтезированной мРНК

Целостность и длину полученной в результате транскрипции in vitro мРНК можно проверить с помощью гель-электрофореза в 1–2,5% агарозном геле.

Очистить мРНК из реакционной смеси можно с помощью переосаждения LiCl, фенол-хлороформной экстракции, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также с использованием методов, основанных на спинколонках.

Количество очищенной мРНК можно оценить с помощью УФ-спектрометрии. Характерный максимум поглощения для РНК: при λ = 260 нм. Для оценки концентрации РНК (мкг/мл) применяется следующая формула: A₂₆₀ × разбавление × 40 мкг/мл. Характерные соотношения оптической плотности достаточно чистой РНК: A₂₆₀/A₂₈₀ ≥ 1.8-2.0, A₂₆₀/₂₃₀ ≥ 1.9.

Условия хранения:

Хранить при температуре -20°С. Срок годности: 12 месяцев