Набор для введения флуоресцентной метки Cy5 в 3’ положение РНК 10 реакций

Набор предназначен для введения флуоресцентной метки Cyanine 5 (Cy5) по 3’-ОН группе молекулы РНК. Спектр поглощения и эмиссии флуоресцентного красителя Cy5 представлен ниже на рисунке.

Состав набора:

Реактивы и оборудование необходимые для работы

• центрифуга, способная достигать скорости не менее 16000 rcf;
• весы аналитические с точностью до 1 мг;
• полиэтиленовые микроцентрифужные пробирки объёмом 0,5 - 2 мл;
• набор автоматических дозаторов;
• этиловый спирт, 96%.

Перед началом работы

Приготовление раствора окислителя:

1. На весах взять навеску 10 - 30 мг окислителя в пробирке объёмом 1,5 мл.
2. Затем в пробирку к окислителю добавить воду, обработанную DEPC.
   Количество воды рассчитать по формуле:
   Объем воды (мл) = масса навески (мг) / 85
3. Перемешать содержимое пробирки до полного растворения кристаллов. Раствор окислителя рекомендуется хранить при комнатной температуре не более 7 дней с момента приготовления. При более низких температурах выпадает осадок (!).

Охладить 96% этиловый спирт до температуры от -19 ^оС до -25 ^оС.

Приготовление 1000 мкл промывочного раствора:

В пробирку объёмом 1,5 мл добавить 800 мкл 96% этилового спирта и 200 мкл воды, обработанной DEPC. Перемешать.

Протокол (1 реакция)

1. Окисление РНК.

• В пробирку вместимостью 0,5 – 1,5 мл добавить 10 мкл буфера для реакции окисления.
• Добавить 1 - 20 мкл образца, содержащего 5 – 150 мкг РНК.
• Добавить 5 мкл готового раствора окислителя.
• Довести реакционную смесь водой, обработанной DEPC, до 50 мкл.
• Перемешать содержимое пробирки и инкубировать в течение 1 ч в темном месте при комнатной температуре (20 – 30 ^оС).

2. Промежуточная очистка РНК.

1. В пробирку с окисленной РНК добавить 5 мкл буфера для осаждения и 150 мкл 96% этанола, предварительно охлажденного до -19 оС. Перемешать встряхиванием.
2. Инкубировать образец при температуре от -19 ^оС до -25 ^оС в течение 15-30 минут.
3. Центрифугировать образец в течение 20 – 30 мин при 16000 rcf и температуре 4 оС.
4. Аккуратно дозатором удалить из пробирки супернатант и внести 200 мкл промывочного раствора. Инкубировать образец с раствором в течение 0,5 - 1 минуты при комнатной температуре.
5. Удалить промывочный раствор. Оставить пробирку с осадком РНК с открытой крышкой в темном месте на 15 – 20 минут для высушивания.

3. Введение флуоресцентной метки в РНК.

1. В пробирку с осадком РНК добавить 35 мкл воды, обработанной DEPC. Перемешать с помощью дозатора до полного растворения осадка.
2. Добавить 10 мкл буфера для реакции с Cy5.
3. Добавить 5 мкл раствора красителя Cy5.
4. Перемешать содержимое пробирки и инкубировать в течение ночи в темном месте при комнатной температуре (20 – 30 ^оС).

4. Очистка меченной Cy5 РНК.

Для очистки РНК от компонентов реакции с красителем выполнить пункт 2 данного протокола.

После высушивания осадка добавить необходимое количество воды, обработанной DEPC, и перемешать. Далее измерить концентрацию РНК любым удобным способом.

Примечание: при применении набора для введения флуоресцентной метки в 100 мкг РНК будет получен препарат, содержащий 70 – 90 мкг РНК с содержанием меченой РНК 50 – 80%.

Условия хранения

Хранить при температуре -20 °С. Срок годности см. на упаковке.

Условия транспортирования

Транспортировку набора производить при температуре -20 °С (допускается транспортировка при 4 °С не более 3х суток).