Обратная транскриптаза M-MuLV–RH (10000 ед. акт.)

M-MuLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от M-MuLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. M-MuLV–RH проявляет оптимальную активность при 42°С (активна до 50 °С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 7 т.о. и включать модифицированные основания.

В набор также входит 5 × ОТ-буфер-mix который содержит все необходимые компоненты для работы ревертазы, кроме праймеров и РНК-матрицы. Состав буфера оптимизирован для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с широкого набора РНК-матриц.

Состав набора

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при 37 °С.

Применение

• Синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени;
• Синтез кДНК для клонирования;
• Получение меченых кДНК зондов для микрочипов (microarray);
• Мечение ДНК.

Свойства M-MuLV–RH ревертазы

• Осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК на РНК-матрице (РНКзависимая ДНК-полимераза);
• Не обладает активностью РНКазы H;
• Позволяет синтезировать фрагменты кДНК длиной до 7 т.о.;
• Обеспечивает высокий выход кДНК: при использовании 100 ед. акт. фермента на 1 мкг РНК выход реакции составляет не менее 100 нг первой цепи кДНК;
• Обладает повышенной термостабильностью;
• Содержит ингибитор РНКаз.

Источник

Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli, экспрессирующего делеционный вариант гена, кодирующего M-MuLV ревертазу.

Буфер хранения

50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 (при 25 °C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0,1 % (v/v) NP-40.

5× ОТ-буфер-mix

250 мM Трис-НCl, рН 8,3 (при 25 °C), 250 мM KCl, 20 мМ MgCl2, 2,5 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 50 мМ дитиотриэтол, стабилизаторы и усилители.

Протокол

Рекомендуем перед началом работ ознакомиться с правилами и рекомендациями, приведенными в описании к набору на сайте

Обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

I Обратная транскрипция (синтез первой цепи кДНК)

После размораживания компонентов набора перемешать смеси и сбросить капли со стенок на микроцентрифуге. Во время работы хранить пробирки во льду.

Примечание: если в 5× ОТ-буфер-mix наблюдается выпадение осадка, нагреть раствор до 45-50 °С и перемешать до его растворения. Не допускайте длительной инкубации буфера при комнатной температуре и выше без необходимости. Это может привести к снижению концентрации ДТТ и падению эффективности реакции.

1. Добавить следующие реагенты в стерильную, свободную от нуклеаз, пробирку во льду в следующем порядке:
   

   РНК-матрица	суммарная РНК или поли(А) мРНК или специфическая РНК	0,1 нг – 5 мкг 10 пг – 0.5 мкг 0.01 пг – 0.5 мкг
   Праймер	олиго(dT)16 или случайный гексапраймер или ген-специфический	1 – 3 мкл 1 – 3 мкл 15-20 пмоль
   Вода, обработанная ДЭПК		До 12 мкл
   	Суммарный объем	12 мкл

2. Аккуратно перемешать и сбросить капли центрифугированием.
   Прогреть смесь 2-3 мин при 70 °С для расплавления вторичных структур и поместить пробирку в лёд.
   Примечание: данная процедура преимущественно необходима при использовании случайного гексапраймера и/или сильно структурированных или GC-богатых матриц.
3. Добавить предварительно приготовленную смесь следующего состава:
   

   5× ОТ-буфер-mix	4 мкл
   M-MuLV –RH ревертаза (100 ед./мкл)	1 мкл
   Вода, обработанная ДЭПК	3 мкл
   Суммарный объем	8 мкл

4. Аккуратно перемешать и сбросить капли центрифугированием.
5. При использовании олиго(dT)16 или ген-специфического праймера для синтеза кДНК инкубировать реакционную смесь 60 мин. при 42 °С. В случае использования случайного гексапраймера инкубировать 10 мин. при 25 °С и затем 60 мин. при 42 °С.
   Примечание: если матрица РНК GC-богата или структурирована, реакцию можно проводить при более высокой температуре (45-50 °С).
6. Реакция останавливается нагревом реакционной смеси до 70 °С в течении 10 мин. Продукт реакции обратной транскрипции может напрямую использоваться в ПЦР-амплификации или храниться при -20 °С не менее одной недели. Для более долгого хранения рекомендуется -70 °С.

II. ПЦР-амплификация первой цепи кДНК

Продукт синтеза первой цепи кДНК может напрямую использоваться в стандартной ПЦР или ПЦР в режиме реального времени. Необходимый объем реакционной смеси после обратной транскрипции составляет не более 1/10 от суммарного объема реакционной смеси ПЦР. В норме используется 2 мкл реакционной смеси ОТ в качестве матрицы для последующей ПЦР в объеме 50 мкл. Для амплификации фрагмента до 5 т.о. в стандартной ПЦР можно использовать БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2×) (MHC10-200, MHC10-1020), БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×) (MH10-200, MH10-1020). Для фрагментов более 5 т. н. рекомендуем использовать БиоМастер LR HS-Taq ПЦР-Color (2×) (MHC040-100, MHC040-400) или БиоМастер LR HS-Taq ПЦР (2×) (MH040-100, MH040-400). Для ПЦР-амплификации в режиме реального времени рекомендуем использовать наборы БиоМастер HS-qPCR (2×) (MH020-400, MH020-2040), БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (MHC030-400, MHC030-2040).

Оптимизация условий реакции

1. В случае необходимости объем реакции можно варьировать от 10 до 50 мкл, пропорционально изменяя количество всех компонентов.
2. Чем короче фрагмент кДНК, тем меньше фермента необходимо добавлять в реакцию.

Рекомендуемое количество M-MuLV–RH ревертазы на реакцию объемом 20 мкл:

Увеличение концентрации РНК-матрицы в реакционной смеси приводит к увеличению суммарного выхода смеси.
Примечание: если количество РНК-матрицы в реакционной смеси более 2 мкг на 20 мкл реакции, для увеличения выхода реакции рекомендуется увеличить не только концентрацию M-MuLV–RH ревертазы, но и концентрацию праймера в 1,5 - 2 раза.

• Для облегчения прохождения участков матрицы, содержащей GC-богатые участки и участки со сложной вторичной структурой, рекомендуется использовать случайный гексапраймер (Random (dN)6).

Примечание: в случае сложных матриц температуру можно поднять до 45-47 °С (повышение температуры до 50 °С приведет к снижению выхода реакции, но способствует преодолению структурированных участков).

Условия хранения

Хранить при -20 °С – 1 год; не более 30 циклов замораживания-размораживания.

Фермент устойчив к инкубации при комнатной температуре (до 7 дней).

Условия транспортировки

Транспортируется в термоконтейнерах с охлаждающими элементами.

Допускается повышение температуры до температуры окружающей среды при транспортировке до 7 дней.