Обратная транскриптаза RNAscribe RT (50000 ед.акт.)

RNAscribe RT – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от M-MuLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность и проявляет оптимальную активность при 55 °С (активна до 65 °С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 9 т.о. и включать модифицированные основания. Его быстрая скорость реакции позволяет выполнять синтез всего за 15 минут, а высокая рабочая температура фермента (до 65 °C) позволяет использовать сложные матрицы и обеспечивает специфичность реакции.

В набор также входит 5× ОТ-буфер-mix, который содержит все необходимые компоненты для работы ревертазы, кроме праймеров и РНК-матрицы. Состав буфера оптимизирован для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с широкого набора РНК-матриц.

Формат набора обеспечивает гибкость при постановке реакции и позволяет проводить предварительную инкубацию РНК с праймерами.

Состав набора

2 × 250 мкл (50000 ед.акт.)

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при 37 °С.

Применение

• Синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени;
• Синтез кДНК для клонирования;
• Синтез кДНК сложных и длинных матриц;
• Получение меченых кДНК зондов для микрочипов (microarray);
• Мечение ДНК.

Свойства RNAscribe RT ревертазы

• Осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК на РНК-матрице (РНК-зависимая ДНК-полимераза);
• Подавлена активность РНКазы H;
• Позволяет синтезировать фрагменты кДНК длиной до 9 т.о.;
• Обеспечивает высокий выход кДНК: при использовании 100 ед. акт. фермента на 1 мкг РНК выход реакции составляет не менее 100 нг первой цепи кДНК;
• Обладает повышенной термостабильностью;
• Содержит ингибитор РНКаз.

Источник

Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего плазмиду с высокоэкспрессирующим геном ревертазы RNAscribe RT.

Буфер хранения

50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 (при 25 °C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0,1 % (v/v) NP-40.

5× ОТ-буфер-mix

250 мM Трис-НCl, рН 8,3 (при 25 °C), 250 мM KCl, 20 мМ MgCl2, 2,5 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 50 мМ дитиотреитол, стабилизаторы и усилители.

Протокол

Рекомендуем перед началом работ ознакомиться с правилами и рекомендациями, приведенными в описании к набору на сайте http://biolabmix.ru

Обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

I. Обратная транскрипция (синтез первой цепи кДНК)

После размораживания компонентов набора перемешать смеси и сбросить капли со стенок пробирок на микроцентрифуге. Во время работы хранить пробирки во льду.

Примечание: если в 5× ОТ-буфер-mix наблюдается выпадение осадка, нагреть раствор до 45-50 °С и перемешать до его растворения.

1. Добавить следующие реагенты в стерильную, свободную от нуклеаз пробирку во льду в следующем порядке:

2. Аккуратно перемешать и сбросить капли центрифугированием. Прогреть смесь 2-3 мин при 70 °С для расплавления вторичных структур и поместить пробирку в лёд.

Примечание: данная процедура не является необходимой, но желательна при использовании случайного гексапраймера и/или сильно структурированных или GC-богатых матриц.

3. Добавить предварительно приготовленную смесь следующего состава:

4. Аккуратно перемешать и сбросить капли центрифугированием.

5. При использовании олиго(dT)16 или ген-специфического праймера для синтеза кДНК инкубировать реакционную смесь 30-50 мин. при 55 °С. В случае

использования случайного гексапраймера или Праймер-микс рекомендуем добавить инкубацию 10 мин. при 25 °С и затем 30-50 мин. при 55 °С.

Примечание: если матрица РНК GC-богата или структурирована, реакцию можно проводить при более высокой температуре (до 65 °С).

6. Реакция останавливается нагревом реакционной смеси до 85°С в течении 5 мин.

Продукт реакции обратной транскрипции может напрямую использоваться в ПЦР-амплификации или храниться при -20 °С не менее одной недели. Для более долгого хранения рекомендуется -70 °С.

II. ПЦР-амплификация первой цепи кДНК

Продукт синтеза первой цепи кДНК может напрямую использоваться в стандартной ПЦР или ПЦР в режиме реального времени. Необходимый объем реакционной смеси после обратной транскрипции составляет не более 1/10 от суммарного объема реакционной смеси ПЦР. В норме используется 2 мкл реакционной смеси ОТ в качестве матрицы для последующей ПЦР в объеме 50 мкл. Для амплификации фрагмента до 5 т.о. в стандартной ПЦР можно использовать БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2×) (MHC10-200, MHC10-1020), БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×) (MH10-200, MH10-1020). Для фрагментов более 5 т. н. рекомендуем использовать БиоМастер LR HS-Taq ПЦР-Color (2×) (MHC040-100, MHC040-400) или БиоМастер LR HS-Taq ПЦР (2×) (MH040-100, MH040-400). Для ПЦР-амплификации в режиме реального времени рекомендуем использовать наборы БиоМастер HS-qPCR (2×) (MH020-400, MH020-2040), БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (MHC030-400, MHC030-2040).

Оптимизация условий реакции

1. В случае необходимости объем реакции можно варьировать от 10 до 50 мкл, пропорционально изменяя количество всех компонентов.
2. Чем короче фрагмент кДНК, тем меньше фермента необходимо добавлять в реакцию.
   Рекомендуемое количество RNAscribe RT ревертазы на реакцию объемом 20 мкл
   

   Длина синтезируемой кДНК	Количество РНК матрицы
   	< 1 нг	500 нг – 2 мкг
   100-2000 п.о.	25-100 ед. акт.	75-150 ед. акт.
   Более 2000 п.о.	100-150 ед. акт.	100-250 ед. акт.

   
   Увеличение концентрации РНК-матрицы в реакционной смеси приводит к увеличению суммарного выхода смеси.
   Примечание: если количество РНК матрицы в реакционной смеси более 2 мкг на 20 мкл реакции, для увеличения выхода реакции рекомендуется увеличить не только концентрацию M-MuLV–RH ревертазы, но и концентрацию праймера в 1,5-2 раза.
3. Для облегчения прохождения участков матрицы, содержащей GC-богатые участки и участки со сложной вторичной структурой, рекомендуется использовать случайный гексапраймер (Random (dN)6).
   Примечание: в случае сложных матриц температуру можно поднять до 55-60 °С (повышение температуры до 65 °С приведет к снижению выхода реакции, но способствует преодолению структурированных участков).

Условия хранения

Хранить при -20°С – 1 год; не более 30 циклов замораживания-размораживания. Фермент устойчив к инкубации при комнатной температуре (до 7 дней).

Условия транспортировки

Транспортируется в термоконтейнерах с охлаждающими элементами, допускается повышение температуры до температуры окружающей среды при транспортировке до 7 дней.