Цифровая система ПЦР QIAcuity - современный подход к ПЦР анализу
Цифровая ПЦР (Digital PCR) представляет собой усовершенствованный метод ПЦР. За счет проведения ПЦР в микрореакторах, этот метод позволяет определить абсолютное число копий в образце. За счет высокой чувствительности можно определить 1 копию молекулы-мишени из 100 тысяч молекул.
В основе цифровой ПЦР лежит метод анализа, при котором многочисленные полимеразные реакции проводятся в независимых друг от друга объемах. Исходный образец разбавляется до состояния 1 молекула / 1 образец. Помещается в лунки на планшете, которые выступают, каждый в отдельности как своеобразный микрореактор. В котором, проходят совершенно не связанные друг с другом реакции ПЦР, то есть единичные молекулы амплифицируются в каждой лунке отдельно. Исходное количество ДНК определяется по соотношению лунок, в которых прошла реакция, к лункам, в которых реакции не было. Оценка количества ДНК базируется на законе распределения Пуассона (распределения случайных величин). При цифровом ПЦР количество капель коррелирует с количеством мишеней в исходном образце. Каждая капля это, по сути, отдельная реакция. Тем самым, чем больше число капель, тем достовернее можно определить исходную концентрацию. При цифровой ПЦР регистрируется только факт самой реакции. Если реакция идет в капле – значит, молекула мишень в ней присутствует.
Метод цифровой ПЦР очень хорош для обнаружения редких мутаций, при обнаружении микроРНК, различных ДНК-мишеней, которые присутствуют в образце в очень маленьком количестве.
Основное различие между классическим метод ПЦР и цифровой ПЦР это то что, в цифровой ПЦР образец разделяется на большое количество отдельных, микроскопических образцов. Каждый из которых анализируется отдельно. Метод, также, идеально подходит для создания библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS).
Определение концентрации патогенов с низким содержанием в источнике выделения, исследования экспрессии генов в одной клетки, анализ метилирования, анализ редких генетических заболеваний.
Преимущества ЦПЦР по сравнению с классической ПЦР
- Не требует градировочных зависимостей и позволяет не использовать в работе дорогие стандартные образцы
- Эффективность ПЦР практически не влияет на результат
- Используются сверхмалые объемы пробы
- Идеально подходит для работы с пробами, в которых содержаться малые концентрации молекул-мишений. Пример: определение редких мутаций, онкомаркеры, работа с микроРНК.
- Обладает более высокой чувствительностью по сравнению с классическим ПЦР
- ЦПЦР хорошо подходит для создания библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS).
