CRISPR/CAS адаптивный иммунитет прокариот на службе у человека
Открытие метода геномного редактирования CRISPR/CAS произвело революцию, как в геномном редактировании, так и во всей биологии. Хотя первый локус CRISPR был обнаружен в бактерии E. Coli в далеком 1987 году, в те времена, не смогли связать наличие этой единицы в геноме бактерий с адаптивным иммунитетом прокариот. Только в дальнейшем, когда были обнаружены повторяющиеся последовательности, разделенные на промежутки, так называемые тандемные повторы, в структуре белков CRISPR и были выявлены спейсеры (промежутки между этими последовательностями). А так же было обнаружено, что эти промежутки соответствуют части генома бактериофагов. Именно тогда ученым удалось связать эту конструкцию с адаптивным (приобретенным) иммунитетом бактерий. А части генома бактериофагов выступают в своем роде образцами (“фотографиями” нарушителей), с которыми бактерия сравнивает агрессора и идентифицирует его как, опасного, а следовательно подлежащего уничтожению.
Простыми словами, при попадании в бактерию какого либо агрессора и при удачном исходе схватки с последним в ген CRISPR попадает “отпечаток” этого агрессора, и в дальнейшем бактерия уже готова к встречи с ним. В упрощенном виде, схоже работает иммунная система у человека, только у нас вырабатываются антитела. Так же у нас запоминание агрессора происходит при введение в организм убитого патогенна (вакцинация). Уже 2002 году были открыты гены CAS, которые входят в состав системы CRISPR. Белки гена CAS отвечают за разрезание генома агрессора, что, без сомнения, является его уничтожением.
И лишь десятилетие спустя (в 2015 году) удалось обнаружить, что система CRISPR/CAS способна функционировать и в организме эукариот. Так же удалось получить искусственную созданную конструкцию CRISPR/CAS9. Именно с этого момента началась новая эра в генной инженерии.
Для того чтобы наиболее полно понять основу этого метода, а на самом деле группы методов, надо понять, как работает иммунитет у бактерий. У прокариот так же есть патогенны, различные вирусы или бактериофаги. В процессе эволюции бактерии научились достаточно эффективно бороться со своими патогеннами. Механизмов защиты, на самом деле достаточно много, но для нас наиболее интересн механизм CRISPR/CAS или механизм адаптивного иммунитета бактерий. У прокариот этот механизм достаточно распространен и встречается у половины прокариот, и у практически всех архей.
Давайте рассмотрим как работает CRISPR/CAS система? Проникшая в бактерию вирусная частица “раздевается”. Это, так называемый процесс, при котором вирус освобождается от своего капсида, высвобождает свой нуклеотид и ферменты для встраивания своего нуклеотида в ДНК клетки хозяина. При благоприятном исходе, на моменте, когда вирусный нуклеотид находится в цитоплазме клетки, срабатывает внутриклеточная защита. Нуклеотид вируса атакуют белки CAS, которые разрезают геном вируса на части, а понравившиеся им фрагменты нуклеотида вируса встраивают в CRISPR кассету на геноме бактерии. Так образуется новый спайсер, а вместе с тем, и новый повтор, тем самым обеспечивая приобретенный иммунитет бактерии к бывшему агрессору. Этот повтор передается по наследству при репликации, тем самым не только сама бактерия приобретает иммунитет к данной вирусной инфекции, но и все дочерни клетки.
Приобретенный иммунитет основан на том, что, организм встречаясь с тем или иным патогенном, запоминает его структуру, или чаше какую то часть его структуры (например, белки из которых состоит шип вируса), и в дальнейшем сталкиваясь с этим вирусом еще раз, быстро распознает его и уничтожает. Это происходит до того момента как вирус производит встройку в геном и запускает процесс репликации.
CRISPR - это clustered regularly interspased short polindromic repeats. Cas 1, Cas 2, Cas 3 - это все CRISPR ассоциированные белки. CRISPR - это в своем роде массив полиндромных повторов и ДНК спайсеров. Спайсер – это частичка патогенна, с которым сталкивалась бактерия, но осталась жива. Процесс этот происходит таким образом: белки Cas1, Cas 2, Cas 9 распознают чужеродный агент, нарезают его ДНК или РНК на кусочки и встраивают его в собственную нуклеотидную последовательность (встраивают новый спайсер), после чего достраивают полиндромный повтор.
При последующем заражении тем же патогенном, система реагирует таким образом, считывается спайсер и сравнивается с патогенном, если последовательность спайсера гомологична последовательности патогенна, тогда белок Cas9 разрезает ДНК патогенна на части, тем самым уничтожая его.
Cas ассоциированные белки имеют определенную специализацию и называются эффекторами. В зависимости от действия эффекторов CRISPR системы разделяются на несколько групп. В первой группе патоген уничтожается белковым комплексом, во втором случае он уничтожается одним белком. Так же некоторые белки CAS могут атаковать только ДНК, другие же только РНК. Очень не многие могут сразу атаковать и ДНК и РНК.
В молекулярной биологии, для редактирования генома, наиболее удобна работа системы второго порядка, там где используется только один белок, так как эта система проще. Эффекторным белком во второй системе является белок кодированный системой CAS9, поэтому и в литературе мы часто видим название метода редактирование генома CRISPR/CAS9.
Как же происходи использование этого метода в генной инженерии?
Сначала изготавливается химерная РНК, в которой объединяются CRISPR, белки CAS и РНК в одну структуру. Создается так называемы вектор. Оказалось, что такая РНК может активировать белок CAS9 и направлять его на нужную часть ДНК, с которой происходит работа. Для того, чтобы использовать эту систему, нам необходима плазмида, в которой будет ген кодирующий белок CAS9 и наша последовательность сшитая с Crisps структурой. Система CRISPR/CAS9, с высокой точностью распознает фрагмент ДНК, который надо порезать, что она и делает. Дальше к работе приступает система репарации. Система репарации видит, что ДНК разорвана, и решает как ей лучше починить. Можно просто сшить куски (негомологичная репарация), или, если есть подходящая матрица, вставить целый участок в ДНК, основываясь на законе гомологичности строения ДНК (этот процесс называется гомологичная репарация). Первый вариант используется, если надо что-то вырезать, второй, если нужно вырезать и что-то вставить.
Безусловно, метод CRISPR/CAS9 имеет свои недостатки, например, он может не совсем точно работать при разрезании ДНК, в частности, “закрывать глаза” на некоторые нуклеотидные несоответствия. В результате, в биологических исследованиях часто может проявляться мазаичность или химеризм. Например, при обработке суспензии из клеток препаратом содержащей CRISPR/CAS9 некоторые клетки могут приобрести необходимые свойства, некоторые нет.
