Измерения концентрации нуклеиновых кислот и белков

Измерение концентраций нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и белков играет важную роль в молекулярной биологии, биохимии и медицине. Для этих целей применяются различные методы, основанные на разных принципах. Давайте рассмотрим эти методы поподробнее.

Электрофоретический метод — это один из основных методов для определения качества нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Он основан на движении заряженных молекул в электрическом поле. Этот метод позволяет оценить целостность, длину фрагментов и степень загрязнения образцов.

Вот как устроен процесс:

5. Подготовка образца: ДНК или РНК обычно смешиваются с индикаторным веществом (например, этидиум бромидом для ДНК), которое связывается с нуклеиновыми кислотами и позволяет их визуализировать под ультрафиолетовым светом.
6. Гель-электрофорез: образец нуклеиновых кислот загружается в гель, обычно агарозный для ДНК или агарозный/полиакриламидный для РНК. Когда на гель подается электрическое поле, молекулы ДНК или РНК начинают двигаться к положительному электроду, так как они отрицательно заряжены.
7. Распределение по фрагментам: Молекулы, чем больше их размер, тем медленнее они движутся через гель. Поэтому на выходе фрагменты молекул распределяются по размеру. Например, молекулы с меньшим размером (небольшие фрагменты ДНК) будут перемещаться дальше, чем большие молекулы.
8. Оценка качества: после проведения электрофореза гель можно визуализировать, например, под ультрафиолетовым светом, если использовался этидиум бромид. Полученная картинка позволяет оценить качество образца. Если молекулы ДНК или РНК сильно повреждены, это обычно проявляется в виде размытых полос или большого количества мелких фрагментов. Для ДНК, например, наличие одной четкой полосы обычно говорит о хорошем качестве (в случае целой молекулы), а множество полос — о фрагментации.
9. Дополнительные анализы: для более детальной оценки качества РНК или ДНК могут быть использованы дополнительные методы, такие как денатурация геля или использование различных маркеров длины фрагментов.

Таким образом, электрофорез позволяет, как оценить качество нуклеиновых кислот, так и провести более сложные анализы, такие как определение их длины, наличие загрязнений или оценка концентрации.

Флуоресцентный метод регистрации результатов в процессе амплификации, используемый в ПЦР в режиме реального времени (реальный-time PCR), основан на наблюдении флуоресцентных сигналов, которые генерируются в процессе амплификации ДНК. Этот метод позволяет отслеживать ход реакции в реальном времени, то есть измерять флуоресценцию после каждого цикла ПЦР, что позволяет оценить количество амплифицированной ДНК.

Суть метода сводится к тому, что целевые молекулы в растворе селективно связываются с красителем, в результате становятся доступными для детектирования с помощью флуориметра. Концентрация вещества оценивается по интенсивности флуоресценции при определённой длине волны. Каждое вещество поглощает свет на определённых длинах волн, что позволяет оценить их концентрацию. Для ДНК и РНК это чаще всего 260 нм. Для белков поглощение наблюдается в области 280 нм из-за присутствия ароматических аминокислот (триптофан, тирозин). Для расчёта обычно используется коэффициент поглощения (ε). 

Так как молекула ДНК сами по себе обладают абсорбцией в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, можно определять молекулу при длине волны 260 нм, где нуклеиновые кислоты поглощают свет.

Измерение концентрации РНК аналогично измерению концентрации ДНК, так как РНК тоже поглощает свет в УФ-диапазоне. Для РНК также измеряют поглощение при 260 нм.

Измерение концентрации белков. Белки поглощают свет на длине волны 280 нм благодаря ароматическим аминокислотам (триптофан, тирозин). При измерении поглощения на 280 нм можно оценить концентрацию белка.

Все реактивы, которые мы предлагаем, являются универсальными и могут быть использованы со всеми распространенными флуориметрами. Но для некоторых из них требуется калибровка.

Преимущества флуоресцентного метода:

• Качественная и количественная информация: этот метод позволяет не только подтверждать наличие целевой ДНК, но и точно оценить её количество в образце.
• Отсутствие необходимости в пост-PCR анализах: нет необходимости в дополнительной стадии, такой как гель-электрофорез, это сокращает время анализа и повышает точность.
• Высокая чувствительность и специфичность: использование специфичных флуоресцентных зондов или красителей позволяет детектировать даже небольшие количества целевой ДНК.

Флуоресцентный метод в молекулярной биологии широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, генетического тестирования, анализа экспрессии генов и других приложений, требующих точного и быстрого количественного анализа ДНК.

Флуорофоры: для оценки концентрации могут использоваться молекулы, обладающие флуоресцентными свойствами (флуорофоры). В случае нуклеиновых кислот это могут быть такие вещества, как SYBR Green или этидиум бромид (для ДНК), которые связываются с нуклеиновыми кислотами и излучают флуоресценцию после возбуждения. Для белков часто используют флуоресцентные красители, такие как флуоресцеин или родамин. Измерение флуоресценции: когда образец подвергается возбуждению светом определенной длины волны, флуорофор излучает свет, и прибор измеряет интенсивность этого излучения. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации вещества, что позволяет количественно оценить его содержание.

Приборы для флуориметрии

Для флуориметрического анализа используются следующие виды приборов:

1. Флуориметр: основной прибор, предназначенный для измерения флуоресценции в образцах. Он состоит из источника света (обычно ультрафиолетового или видимого), системы фильтров, детектора и спектрометра для измерения излучения. С помощью фильтров можно выбрать возбуждающую и эмиссионную длины волн, которые соответствуют флуорофору.
2. Спектрофлуориметр: более продвинутый прибор, который позволяет измерять спектры флуоресценции, то есть излучение на разных длинах волн. Это может быть полезно, если нужно изучить взаимодействие различных флуорофоров или провести более точный количественный анализ.

Реактивы и красители для флуориметрии

Для определения концентрации нуклеиновых кислот и белков в флуориметрии используются специфические флуоресцентные красители:

Для нуклеиновых кислот:

1. SYBR Green: краситель, который связывается с двойной спиралью ДНК и флуоресцирует при возбуждении ультрафиолетовым светом. Он используется в ПЦР для обнаружения амплифицированной ДНК, но также может применяться для определения общей концентрации ДНК в образцах.
2. Этидиум бромид (EtBr): это один из самых старых и распространенных красителей для ДНК, который связывается с двуспиральной ДНК и флуоресцирует под ультрафиолетовым светом. Однако он токсичен, и его использование требует осторожности.
3. PicoGreen: специфичный флуоресцентный краситель для измерения концентрации ДНК. Он связывается только с двойной спиралью ДНК, и его флуоресценция пропорциональна количеству ДНК.
4. RiboGreen: используется для количественного определения РНК, связываясь с молекулами РНК и флуоресцируя при возбуждении.

Для белков:

1. Флуоресцеин: используется для маркировки белков и измерения их концентрации. Это один из наиболее популярных флуоресцентных красителей для белков.
2. Биуретовый метод: также применяется в сочетании с флуоресценцией для оценки концентрации белков в образцах.
3. BCA (Bicinchoninic Acid) Assay: системы на основе BCA также могут быть использованы с флуоресцентными детекторами для измерения концентрации белков.

Таким образом, флуориметрия является мощным и универсальным инструментом для количественного анализа нуклеиновых кислот и белков, широко используемым в научных исследованиях, медицинской диагностике и биотехнологии.