Методы определения качества нуклеотидов перед секвенированием

Определение качества и количества ДНК и РНК перед секвенированием является критически важным этапом, так как качество и количество исходного материала напрямую влияет на результаты секвенирования. Существует несколько наборов и методик для оценки качества ДНК и РНК. Вот обзор популярных методик определения качества нуклеотидов.

Методы оценки качества нуклеотидов

1. Спектрофотометрия

Используется для оценки чистоты и концентрации нуклеотидов. Основные показатели включают:

  -  Соотношение A260/A280: для оценки чистоты образца (значение 1.8-2.0 для ДНК и 2.0-2.2 для РНК).

  - Соотношение A260/A230: для оценки присутствия органических загрязнителей (значение выше 2.0 для чистых образцов).

Приборы:

- NanoDrop (Thermo Fisher Scientific): популярный спектрофотометр для быстрой оценки чистоты и концентрации нуклеотидов.

Преимущества:

- Высокая чувствительность и точность.

- Минимальное влияние загрязнителей.

Недостатки:

- Требует специальных реагентов и оборудования.

2. Флуориметрия

Используется для точного количественного определения нуклеотидов с помощью флуоресцентных красителей.

Приборы и наборы:

- Qubit Fluorometer (Thermo Fisher Scientific): с наборами для ДНК (Qubit dsDNA HS Assay Kit и РНК (Qubit RNA HS Assay Kit.

- PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific): для высокочувствительного количественного определения двуцепочечной ДНК.

Преимущества:

- Быстрый и простой метод.

- Подходит для оценки чистоты и концентрации одновременно.

Недостатки:

- Возможность искажения результатов при наличии загрязнителей (белков, фенола и т.д.).

3. Электрофорез на агарозном геле

Метод для визуальной оценки  ДНК и РНК. Образцы наносятся на агарозный гель и подвергаются электрофорезу, что позволяет увидеть наличие или отсутствие деградации.

Приборы:

- Горизонтальные электрофорезные системы: производства компаний Bio-Rad, Lonza и Thermo Fisher Scientific.

 Преимущества:

- Визуальная оценка целостности и размера фрагментов.

- Возможность определения присутствия деградации.

Недостатки:

- Более длительный и трудоемкий процесс по сравнению с спектрофотометрией и флуориметрией.

4. Микрофлюидный электрофорез

Современный метод, обеспечивающий высокую точность оценки качества и размера фрагментов ДНК и РНК.

Приборы:

- Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies): система для оценки качества ДНК и РНК, используя микрофлюидные чипы.

- Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies): аналогичная система для оценки качества и концентрации нуклеотидов.

- Fragment Analyzer (Agilent Technologies): автоматизированная система для анализа качества и размера фрагментов ДНК и РНК.

5. Капиллярный электрофорез

Используется для точной оценки размера и концентрации нуклеотидов.

Приборы:

- Advanced Analytical Technologies Fragment Analyzer (Agilent Technologies): автоматизированная система для оценки качества и концентрации нуклеотидов.

Основные производители оборудования и реагентов

- Thermo Fisher Scientific: производит спектрофотометры NanoDrop, флуориметры Qubit, а также наборы Qubit Assay Kits и PicoGreen Assay Kit.

- Agilent Technologies: производит микрофлюидные системы Bioanalyzer и TapeStation, а также Fragment Analyzer.

- Bio-Rad: предлагает широкий ассортимент горизонтальных электрофорезных систем и реагентов для гелевого электрофореза.

- Lonza: производит системы для электрофореза и различные реагенты для анализа ДНК и РНК.

Рекомендации по выбору методов и приборов

1. Для оценки чистоты и концентрации:

- Используйте спектрофотометр NanoDrop для быстрой оценки соотношений A260/A280 и A260/A230.

- Для точного количественного определения используйте флуориметр Qubit с соответствующими наборами.

2. Для оценки целостности и размера фрагментов:

- Используйте микрофлюидные системы, такие как Agilent Bioanalyzer или TapeStation, для точной оценки качества и размера фрагментов ДНК и РНК.

- При отсутствии доступа к микрофлюидным системам, можно использовать стандартный агарозный гелевый электрофорез для визуальной оценки целостности нуклеотидов.

3. Для высокоточной оценки размера и концентрации:

 - Рассмотрите использование капиллярного электрофореза на системах, таких как Fragment Analyzer от Agilent Technologies.

Выбор методов и приборов для определения качества нуклеотидов перед секвенированием зависит от конкретных задач и доступного оборудования. Использование комбинации методов (спектрофотометрия, флуориметрия, электрофорез) позволяет обеспечить комплексную оценку качества ДНК и РНК, что является критически важным для успешного секвенирования и получения надежных данных.

Рекомендации по выбору метода

Для оценки чистоты и концентрации:

- Спектрофотометрия (NanoDrop): Быстрая и простая оценка, подходит для большинства лабораторий.

- Флуориметрия (Qubit): Для высокой точности и чувствительности, особенно при работе с малыми концентрациями.

Наборы для определения качества нуклеотидов

Оценка качества ДНК и РНК https://snablab.ru/catalog/sekvenirovanie-2/kolichestvennaya-oczenka/