Различия между методами секвенирования по Сэнгеру и NGS

Методы секвенирования по Сэнгеру (Sanger sequencing) и секвенирования следующего поколения (Next-Generation Sequencing, NGS) являются двумя основными подходами к определению последовательности нуклеотидов в ДНК, но они значительно различаются по своей технологии, возможностям и применению. Вот ключевые различия между этими методами:

1. Технология

• Секвенирование по Сэнгеру:

Основано на методе цепной терминальной модификации, где используется ДНК-полимераза для синтеза новой цепи ДНК, при этом добавляются метки в виде флуоресцентных или радиоактивных нуклеотидов.

Каждый раз, когда добавляется модифицированный нуклеотид (дидезоксинуклеотид), синтез цепи прерывается, что приводит к получению фрагментов разной длины.

Эти фрагменты затем разделяются методом капиллярного электрофореза, что позволяет определить последовательность ДНК по длине фрагментов по их флуоресцентной метке.

• NGS:

 Включает множество параллельно выполняемых реакций, что позволяет одновременно секвенировать миллионы фрагментов ДНК.

В зависимости от платформы, используются различные подходы, такие как массово-параллельное секвенирование, пиросеквенирование, секвенирование по терминаторным нуклеотидам и другие.

Результаты обрабатываются и анализируются с помощью сложных алгоритмов и компьютерных программ для сборки конечной последовательности.

2. Продуктивность и масштаб

Секвенирование по Сэнгеру:

• Способно секвенировать только одну цепь ДНК за один раз;
• Длина прочтения составляет около 500–1000 пар оснований;
• Подходит для секвенирования отдельных генов или небольших участков ДНК, таких как плазмиды или отдельные амплифицированные продукты.

Также метод секвенирования по Сэнгеру известен своей высокой точностью и надежностью. Точность секвенирования составляет примерно 99.99%, что делает его "золотым стандартом" для проверки и подтверждения результатов, полученных другими методами

Секвенирование NGS:

• Способно секвенировать миллионы фрагментов ДНК одновременно.
• Длина прочтений может варьироваться от 50 до 300 базовых пар для короткочтения и до нескольких тысяч базовых пар для технологий длинного прочтения (например, PacBio или Oxford Nanopore).
• Идеально подходит для секвенирования геномов, транскриптомов, метагеномных исследований и других крупных проектов.

3. Точность и надежность

Секвенирование по Сэнгеру:

• Известно своей высокой точностью (примерно 99.99%).
• Используется как "золотой стандарт" для подтверждения последовательностей, полученных другими методами.

Секвенирование по Сэнгеру широко доступно, легко автоматизируется и требует меньше сложного программного обеспечения для анализа данных по сравнению с NGS. Это позволяет лабораториям без значительных ресурсов выполнять секвенирование самостоятельно.

Секвенирование NGS:

• Точность может варьироваться в зависимости от технологии и платформы.
• Несмотря на возможность появления ошибок при отдельных чтениях, благодаря высокой покрываемости (coverage) и сложным алгоритмам обработки, NGS дает достаточно точные результаты для большинства применений.

4. Скорость и стоимость

Секвенирование по Сэнгеру:

• Более медленный и дорогостоящий процесс при работе с большими объемами данных, поскольку каждый образец нужно секвенировать индивидуально.
• Обычно дешевле и быстрее для секвенирования небольших участков ДНК.

Секвенирование NGS:

• Высокая скорость секвенирования больших объемов ДНК и более низкая стоимость на основании (при работе с большими данными).
• Экономически выгоден для проектов, требующих секвенирования тысяч или миллионов образцов.

5. Применение

Секвенирование по Сэнгеру:

• Используется для анализа небольших последовательностей, таких как отдельные гены, валидации результатов NGS, секвенирования отдельных клонированных фрагментов ДНК.

Идеален для проверки мутаций и полиморфизмов.

• В клинических и научных исследованиях секвенирование по Сэнгеру часто используется для проверки конкретных мутаций или генетических вариантов после их первоначального обнаружения другими методами, что делает его ценным инструментом для валидации данных.

Секвенирование NGS:

• Используется в крупных геномных проектах, метагеномике, исследованиях транскриптомов, выявлении мутаций и полиморфизмов в больших популяциях, секвенировании РНК, эпигенетических исследованиях.

NGS позволяет легко масштабировать проекты, добавляя больше образцов или увеличивая объем данных, тогда как метод Сэнгера не так легко масштабируется, особенно при необходимости секвенирования большого количества образцов.

Многообразие приложений для метода секвенирования NGS

NGS используется для различных целей, включая полногеномное секвенирование, секвенирование экзома, RNA-секвенирование (RNA-seq), эпигеномные исследования, секвенирование микробиома и другие, что делает его универсальным инструментом для разных исследований. Метод Сэнгера в основном используется для секвенирования отдельных генов или небольших участков ДНК.