Выделение нуклеиновых кислот. Ручные и автоматизированные методы.

Впервые нуклеиновую кислоту (далее НК) выделил швейцарский врач Фридрих Мишер в 1869 году. С тех пор процесс выделения нуклеиновых кислот превратился в рутину и этого этапа не удается избежать ни одному исследователю, работающему с генетическим материалом. Качественно проведенная очистка практически гарантирует получение достоверных результатов.  Автоматизация этого процесса снижает до нуля вероятность контаминации образца посторонним генетическим материалом и исключает “человеческий фактор” – а это основные причины возникновения ошибок в генетических лабораториях.   

Рассмотрим ручное выделение нуклеиновых кислот, так как в основе автоматических методов лежат те же самые манипуляции, только проделанные не лаборантом, а роботом.

Ручной метод выделения НК весьма трудоемкий и частично проводится в вытяжном шкафу, поскольку работать приходится с высокотоксичными веществами, такими как органические растворители: спирты, фенол и хлороформ. Кроме того, необходимо соблюдать меры предосторожности, связанные с тем что биологический материал исследователя (кожа, волосы и т.д.) может попасть в исследуемый образец и загрязнить его.

Разберем процесс выделения и очистки нуклеиновых кислот поэтапно.

На первом этапе мы проводим лизис клеток. Наша цель разрушить клеточные стенки и клеточные структурные образования.  Для этого используются различные ферменты, например лизоцим при работе с бактериальными клетками.  Главное чтоб произошел процесс разрушения клеточной стенки и плазматической мембраны. Далее в раствор добавляются специальные ферменты, протеазы - с помощью этих ферментов разрушаются белки и фермент РНКаза с помощью нее мы избавляемся от примесей РНК. Для того чтоб процесс прошел максимально качественно, суспензию содержащую вышеперечисленные ферменты и наши клетки необходимо перемешать на вортексе при температуре 37⁰С. Процесс занимает примерно 30 минут. 

После завершения реакции в растворе, который ранее содержал клетки исследуемого организма, находится смесь НК, сахара, липиды, переваренные белки и ферменты. Приступаем ко второму этапу. На этом этапе мы будем получать раствор, содержащий НК в чистом виде.  Для того чтобы получить чистую нуклеиновую кислоту, необходимо избавиться от всех примесей, которые содержаться в растворе. Для этого используют природную способность НК растворяться в воде и не растворяться в органических растворителях.  Как правило, на этом этапе используют смесь фенола с хлороформом или эти органические растворители по отдельности. Фенол является органическим растворителем, который способен разрушить ДНК белковые связи, белки и растворить неполярные органические молекулы. НК является полярными молекулами и не растворяется в органических растворителях, а остается в водной фазе. И фенол и хлороформ токсичны и необходимо работать в вытяжном шкафу.

Далее центрифугируем пробирку для разделения водной фаза и органической фазы. В результате центрифугирования наша смесь разделилась на две фракции по плотности. Верхнюю – более легкую содержащую водный раствор НК, и нижнюю, более плотную, состоящую из фенола и содержащихся в нем органических веществ. Далее, верхнюю фазу, содержащую НК необходимо перенести  в чистую пробирку. Промывку производят несколько раз.

Полученный раствор может содержать примеси органических растворителей и химических элементов, которые мы использовали для очистки НК. На третьем этапе нам необходимо избавиться от этих элементов и осадить НК. Для этого используют спирт в присутствии солей. Например, соль натрий хлор и спирт пропанол или изопропанол. ДНК выпадает в осадок и мы можем наблюдать белые хлопья. Процесс осаждения происходит лучше при температуре -30. После того как ДНК выпала в осадок мы можем отобрать спирт из пробирки а затем остатку спирта дать испариться.

Далее мы растворяем ДНК в воде, обычно это происходит в течении нескольких дней при температуре  5⁰С. Но если нам необходимо провести срочное исследование можно использовать термошейкер с охлаждением.  В этом случае растворение, возможно будет не полным, но полученной НК будет достаточно.

В результате мы получаем раствор очиненной НК в воде, которую мы можем  анализировать.

Только что мы разобрали ручной способ выделения нуклеиновых кислот. В наше время на рынке существует множество коммерческих наборов для выделения нуклеиновых кислот. Что значительно упрощает работу лаборанта и решается проблему работы с токсичными веществами где нам необходим вытяжной шкаф.

Большинство коммерческих технологий основано на принципе НК адсорбироваться на положительно заряженном специфическом сорбенте. Отрицательно заряженная ДНК связывается с положительно заряженным сорбентом, а липиды, белки, полисахариды  не связываются и в процессе промывки удаляются.  Далее используется еще одно свойство нуклеиновых кислот  - способность растворяться в воде. Путем промывки сорбента водой НК переходит в жидкую фазу.

Как мы смоли заметить ручной процесс выделения нуклеиновых кислот весьма трудозатратный и требует специфических условий и навыков лаборанта, таких как работа в вытяжном шкафу и работа с высокотоксичными веществами. Но помимо этого, ручное выделение несет в себе серьезный риск контаминации и технической ошибки связанной с человеческим фактором.

В крупных генетических лабораториях все процессии автаматизированны и работа лаборанта сводится к тому, что просто выбрать ту или иную программу на приборе. Но для многих небольших лабораторий процесс автоматизации по прежнему недоступен, по причине дороговизны приборов и реактивов к ним.  

В этой статье мы рассмотрим принципы выделения рибонуклеиновых кислот и преимущества автоматических методов  выделения рибонуклеиновых кислот над ручными методами.

Рассмотрим автоматизацию процесса выделения рибонуклеиновых кислот и белков с помощью роботизированной станции QIAcube Connect от компании Qiagen. Эта технология признана “золотым” стандартом в генетических лабораториях. Уникальность этого прибора – это его универсальность. Прибор адаптирован для использования более чем 80 различных наборов. Более 3000 различных протоколов.

В основе работы станции лежит принцип движения жидкости через мембрану за счет центробежной силу, которая создается центрифугой. Лизис клеток протекает при повышенной температуре в термошейкере.  Наличие на борту QIAcube Connect таких элементов делает станцию универсальной, позволяет выделать геномный материал из широкого спектра клеток в том числе и вирусных частиц. Станция серьезно сокращает время на технические процедуры. Так же есть возможность использовать отдельно как шейкер так и центрифугу что значительно повышает эффективность лаборатории в целом.

Автоматическая станция QIAcube в сочетании с оригинальными наборами для выделения  нуклеиновых кислот и белков производства компании Qiagen являются золотым стандартом в генетических лабораториях.

Наша компания занимается комплексное оснащение генетических лабораторий любого направления.  Предлагаем решения от самого первого этапа – сбор и  консервация генетического материала до самого последнего –  биоинформатическая обработка результатов.

В нашем портфолио собраны уникальные приборы, благодаря которым существенно упрощается работа лаборанта, снижается вероятность контаминации и получаются достоверные результаты

С тех пор процесс выделения нуклеиновых кислот превратился в рутину и этого этапа не удается избежать ни одному исследователю, работающему с генетическим материалом. Качественно проведенная очистка практически гарантирует получение достоверных результатов. Автоматизация этого процесса снижает до нуля вероятность контаминации образца посторонним генетическим материалом и исключает “человеческий фактор” – а это основные причины возникновения ошибок в генетических лабораториях.