Набор mini для выделения ДНК и РНК из реакционных смесей

Набор предназначен для выделения и очистки ДНК и РНК (от 50 до 10000 нт) из реакционных смесей объёмом до 100 мкл. Возможна очистка, например, от dNTP, ферментов, не включившихся низкомолеклярных радиоактивных и флуоресцентных меток и др.

Принцип действия набора основан на селективной сорбции нуклеиновых кислот из предварительно лизированного образца на кремниевой мембране, последующей промывке и элюции очищенного продукта. Возможна очистка до 50-200 мкг ДНК или РНК. Выход ДНК или РНК не более 80% и зависит от типа, длины и количества НК в реакционной смеси. Элюция ДНК или РНК происходит в 60-200 мкл.

Выделенные ДНК и РНК могут быть использованы для ПЦР, транскрипции, никтрансляции, секвенирования и других генно-инженерных приложениях.

Набор не содержит фенола и хаотропных солей, таких как гуанидин тиоцианат и др.

Состав набора

Набор DR-250 поставляется в одном из двух вариантов

Эксплуатация

Компоненты: DS, PB, WB, EBD, EBR стабильны после вскрытия флаконов при температуре от +15°С до +25°С стабильны в течение всего срока годности при соблюдении условий хранения (см. на упаковке) и достаточной герметизации флаконов.

Условия работы

Температура окружающей среды от +15 до +25°С;

Относительная влажность воздуха не более 80 %;

Атмосферное давление 630 – 800 мм. рт. ст.

Оборудование и материалы, не входящие в набор

• Центрифуга для микропробирок на 1.5-2 мл, скорость 10000 rcf;
• Вортекс;
• Одноканальные дозаторы переменного объёма и наконечники для них;
• Перчатки резиновые;
• Микропробирки на 1.5-2.0 мл;
• Этанол, 96-100% раствор.

Перед началом работы

Подготовка буфера WB.

• 1 выделение, 500 мкл WB. К 100 мкл буфера WB (концентрат) добавить 400 мкл 96-100% этанола.
• 10 выделений. К 1.1 мл буфера WB (концентрат) добавить 4.4 мл 96-100% этанола, чтобы получить 5.5 мл буфера WB.
• 50 выделений. К 6 мл буфера WB (концентрат) добавить 24 мл 96-100% этанола, чтобы получить 30 мл буфера WB.
• 250 выделений. Вариант 1. К 10 мл буфера WB (концентрат) добавить 40 мл 96-100% этанола, чтобы получить 50 мл буфера WB.
• 250 выделений. Вариант 2. К 15 мл буфера WB (концентрат) добавить 60 мл 96-100% этанола, чтобы получить 75 мл буфера WB.

Рекомендуется добавлять этанол к аликвоте буфера WB, поскольку при хранении буфера с этанолом в течение нескольких месяцев этанол может частично испариться.

Протокол выделения ДНК или РНК.

1) Подготовка образцов.

1. При работе с образцами объёмом менее 100 мкл довести объём образца до 100 мкл раствором для разбавления образца DS.
2. К аликвоте образца добавить пятикратный избыток буфера для нанесения на колонку. Например, к 100 мкл образца добавить 500 мкл буфера для нанесения на колонку PB.
3. Перемешать образец на вортексе 5-10 с или пипетированием.
4. Сбросить капли коротким центрифугированием.

2) Нанесение на колонку.

1. После подготовки образец сразу перенести на колонку не более 800 мкл образца. Плотно закрыть крышку колонки.
2. Центрифугировать 30 с, 10000 rcf. Удалить фильтрат.
   Примечание: если объём образца более 800 мкл, повторно нанести избыток на ту же колонку и повторить центрифугирование.

3) Промывка колонки.

1. Нанести на колонку 500 мкл буфера для промывки WB. Центрифугировать 30 с, 10000 rcf. Удалить фильтрат.
   Примечание: не забудьте предварительно добавить к буферу WB этанол.
2. Центрифугировать колонку 3 мин, 10000 rcf для полного удаления буфера WB.

4) Элюция ДНК или РНК.

1. Перенести колонку в новую микропробирку на 1.5-2 мл (не входит в состав набора). Плотно прижать колонку к пробирке.
2. Нанести на центр фильтра колонки от 60 мкл до 200 мкл буфера для элюции ДНК EBD или буфера для элюции РНК EBR. Инкубировать 3 мин при комнатной температуре (15-25°С). Центрифугировать 2 мин, 10000 rcf.
   • Важно! Рекомендуемый объём элюции 100 мкл. При элюции меньшим объёмом требуется аккуратно наносить аликвоту буфера на центр фильтра колонки, иначе возможно снижение выхода РНК.
   • Важно! Если ожидаемый выход длинных дцДНК (более 10 тыс. нт.) более 15-20 мкг или коротких НК (ДНК, плазмидная ДНК или РНК до 10 тыс. нт.) более 100 мкг, то рекомендуемый объём элюции 150-200 мкл. При элюции меньшим объёмом возможно снижение выхода ДНК или РНК.
   • Повторная элюция новой аликвотой буфера для элюции или элюатом позволяет увеличить выход ДНК или РНК на 10-30%. При элюции объёмом менее 100 мкл рекомендуется использовать новую аликвоту буфера для элюции. При элюции объёмом 100 мкл и более допускается повторно нанести элюат на колонку.
   • Буфер для элюции EBD – 0.01 М Tris•HCl (pH 8.0). Элюцию можно проводить TE буфером (0.01 М Tris•HCl, 0.001 М EDTA, pH 8.0-8.5) или водой (pH 8.0-8.5, pH доводить раствором NaOH).
   • Для длительного хранения ДНК рекомендуется добавить EDTA (pH 8.0) до конечной концентрации 0.1-1 мМ.
     Примечание: EDTA может ингибировать ферментативные реакции, например, ПЦР.
   • Буфер для элюции РНК EBR – вода, очищенная от РНКаз.
3. Элюат, содержащий ДНК или РНК, хранить при -20°C.

Анализ выделенных ДНК или РНК

ДНК и РНК можно проанализировать с помощью гель-электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Количество выделенных ДНК или РНК можно оценить с помощью УФспектрометрии.

Характерный максимум поглощения для ДНК и РНК при λ = 260 нм.

Посчитать концентрацию ДНК или РНК (мкг/мл) можно по следующей формуле:

A₂₆₀ * разбавление * 50 мкг/мл. Для дцДНК

A₂₆₀ * разбавление * 33 мкг/мл. Для оцДНК

A₂₆₀ * разбавление * 40 мкг/мл. Для РНК

Характерные соотношения оптической плотности A260/A280 ~1.7-2.0.

Примечание: в зависимости от количества образца ДНК или РНК в реакционной смеси количество выделенных ДНК или РНК может быть ниже уровня, детектируемого с помощью гель-электрофореза или УФ-спектрометрии. При значениях концентраций образцов менее 10-20 нг/мкл рекомендуется подтвердить полученные значения методами флуориметрии или ПЦР.

Дополнительные реагенты:

• Буферы для электрофореза в агарозном геле: трис-ацетатный буфер (Кат. № BE-DNA-500, BE-DNA-1000), трис-боратный буфер (Кат. № TBE-500).
• Раствор бромистого этидия (Кат. № EtBr-10) для визуализации НК.
• Буферы для внесения образцов ДНК и РНК в гель (Кат. № D-3001, D-3002, D-3003).
• Маркеры молекулярных весов ДНК (Кат. № S-8000, S-8100, S-8103, S-8055, S-8250, S-8150).

Условия хранения:

Набор хранить при температуре от +15 до +25 °C. Срок годности см. на упаковке.

Условия транспортировки:

Транспортировку набора, производить при температуре от +15 до +25 °C.