Молекулярная генетика в бактериологии

Молекулярно-генетические методы сегодня являются одним из наиболее современных технологически развитых приемов выявления и идентификации микроорганизмов. Основанные на амплификации нуклеиновых кислот этот метод позволяет достичь высокой диагностической чувствительности и специфичности в сочетании с высокой скоростью проведения исследования. В отличие от бактериологических методов, молекулярные не требует предварительного культивирования микроорганизмов для их идентификации, что позволяет применять этот метод для обнаружения некультивированных микроорганизмов.

Именно сейчас происходит беспретендентное по масштабу внедрение молекулярной диагностики. Причина этому – эпидемия COVID 19, которая поставила перед исследователями вопрос по экстренной разработке тест-систем для быстрой идентификации вируса, причем на ранней и даже до клинической стадии. При этом отсутствие специфических признаков патологии у большинства пациентов предъявляла дополнительные требования к тест-системам, анализ должен быть направлен на сам вирус, а не на физиологические последствия его активности.

Молекулярно-генетические методы оказались оптимальными для решения этой задачи. Тест-системы, рассчитанные на обнаружение РНК вируса с высокой специфичностью, они позволили дифференцировать вирус SARS-COV-2 от других вирусов респираторной группы.

Так же в противоположность бактериологическому культивированию генетическая диагностика не подразумевает накопления бактериальной массы в искусственных условиях, что является, несомненно, преимуществом метода. Кроме того, уже на стадии лизиса и выделение нуклеиновой кислоты уже происходит обеззараживание агента, что является наиболее безопасным для персонала и окружающей среды.

Появление высокопроизводительного секвенирования дало значительный толчок в развитии микробиологии и смежных областях. В связи с тем, что процесс стал более доступным для рутинных исследований, прежде всего за счет снижения стоимости секвенирования, в настоящее время мы наблюдаем взрывной рост публикаций на тему генома бактерий в открытых источниках. Для некультивируемых микроорганизмов, геномные методы стали важнейшими способами их изучения. Другая область применения NGS в микробиологии – это медицина. Исследование генома некоторых микроорганизмов методом NGS позволяет быстро и достоверно выявить “островки патогенности” или локусы в нуклеосоме, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или защиту от иммунной системы.

Наиболее продолжительным и трудозатратным этапом любого геномного проекта это завершение в полной кольцевой сборкой молекулы ДНК, на сегодняшний день с помощью NGS 98% генома можно получить в течение недели.

Анализ микробного сообщества, секвенирование ампликонов

Для исследования таксономического состава прокариот в какой-либо среде обитания используют методы, основанные на секвенировании высококонсервативных регионов генома. Чаще всего для этого выбирают ген 16s рибосомальной РНК (16S рРНК) или используют ITS анализ. У гена 16S рРНК (длиной около 1500 п.н.) есть константные и вариабельные участки. Константные участки позволяют создать универсальный праймер для ПЦР, взаимодействующего с ДНК большинства прокариот с примерно равной эффективностью. Методом ПЦР можно наработать расположенные между такими праймерами вариабельные участки гена 16S рРНК. Секвенирование одного или нескольких вариабельных регионов позволяет идентифицировать последовательности, принадлежащие разным видам.

Крайне важным является подбор пары праймеров для идентификации гена 16S рРНК. Так как даже константные участки этого гена могут иметь однонуклеотидные вариации, в результате чего эффективность амплификации может существенно различаться в зависимости от вида.

Несомненным плюсом использования в качестве маркера гена 16s РНК при анализе симбиотического микробиоценоза является исключение из анализируемого образца ДНК организма-хозяина.

Последовательность шагов может быть следующая:

1. Секвенирование короткого вариабельного участка (чаще всего это фрагмент или несколько фрагментов 16S рРНК);
2. Секвенирование метагенома;
3. Анализ прочтений 16s рРНК в метагеноме и их классификация;
4. Удаление из результата всех не классифицируемых данных;
5. Анализ сообщества по кратности прочтения контигов 16S рРНК (чем больше прочтений 16S рРНК, тем больше данного микроба в сообществе содержится);
6. Сопоставление результатов двух подходов.