Пробоподготовка биоматериала для ПЦР
Выделение ДНК (РНК), белков
Надо проводить в вытяжном шкафу Бокс ламинарный микробиологической безопасности ЛБ-1К.
Для того чтоб выделить ДНК надо прежде всего лизировать клетки. Если мы говорим об обычных клетках, то в этом случае часто используют фермент лизоцим. Он растворяет клеточную оболочку, тем самым высвобождая содержимое клетки в раствор. Перед обработкой клеточной суспензии лизоцимом, мы концентрируем исследуемые клетки с помощью центрифугирования, идеально подойдет Микроцентрифуга D1008. После осаждения выделяем суспензию клеток из пробирки. Если мы исследуем ДНК мы обрабатываем раствор специальными ферментами РНКазами, для деградации РНК. Процесс очистки проходит в пробирках при постоянном перемешивании и температуре 37 градусов. Для этого используют вортекс MX-S или термостат твердотельный TDB – 120. Так же этот вопрос может решить термошейкер для микропробирок от компании Biosan –TS-100C.
После инкубации в пробирки добавляем следующее компоненты: протеиназы - специальные ферменты разрушающие белки. Инкубируем в термостате термостат твердотельный TDB – 120 в течении часа при температуре +55 градусов. Теперь в растворе содержаться: ДНК, сахара, липиды, аминокислоты, ферменты. Для того чтоб работать с ДНК нам надо избавиться от всей органики кроме соответственно ДНК.
Для этого мы используем смесь фенола и хлороформа. Фенол и хлороформ является органическим растворителями, они разрушает гистоновые связи ДНК, денатурирует белки и растворяет часть органических молекул. ДНК же не растворяется в феноле и остается в водной фазе. Фенол является токсичным, поэтому работа с ним должна проводиться в Бокс ламинарный микробиологической безопасности ЛБ-1К.
Далее мы центрифугируем пробирку, для того чтоб разделить водную фазу и органическую. Для этого идеально подойдет микроцентрифуга Microspin -12.
Наша смесь разделилась на две фазы: верхнюю более легкую, в контрой содержится водный раствор ДНК, и нижнюю, более тяжелую в которой содержится растворенные в феноле и хлороформе органические соединения. Далее нам необходимо перенести верхнюю фазу в чистую пробирку. Это и есть водный раствор нашей ДНК. Так как в растворе все равно содержится много различных примесей, для того чтоб избавиться от этих примесей необходимо осадить ДНК. Добавляем спирт и натрий хлор. Для перемешивания используем вортекс MX-S. И центрифугируем пробирку Микроцентрифуга D1008 около 20 минут. Белый осадок на дне пробирки это и есть наша ДНК. Далее пробирка с ДНК ставиться в термостат термостат твердотельный TDB – 120 для того чтоб спирт испарился и дальше можно растворить ДНК в воде. Тем самым мы получим водный раствор ДНК.
