• Напишите нам
  • mail@snablab.ru
+7(495)660-35-58 Перезвоните мне
Пн. - Чт.: с 9.00 до 18.00
Пт.: с 9.00 до 17.00

Каталог

Секвенирование по Сэнгеру. Обзор метода.

Секвенирование по Сэнгеру - это классический метод анализа последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК. Он был разработан Фредериком Сэнгером в 1977 году и остается широко используемым методом, несмотря на появление более современных технологий секвенирования NGS (Рис 1).

Рисунок 1.

              Принцип секвенирования по Сэнгеру заключается в том, что ДНК или РНК, содержащие последовательность нуклеотидов, разрываются на отдельные молекулы, которые затем помечаются и расшифровываются. Процесс состоит из нескольких этапов: ПЦР, чтобы увеличить количество ДНК, денатурации, чтобы разделить двойную спираль на одиночные нити, синтеза, чтобы добавить меченные нуклеотиды, и анализа полученных фрагментов методами электрофореза (Рис 2).

              Секвенирование по Сэнгеру имеет ряд преимуществ, таких как высокая точность и надежность результатов, возможность анализа относительно небольших фрагментов ДНК или РНК, а также возможность обнаружения мутаций и полиморфизмов на уровне одиночного нуклеотида.

              Сегодня секвенирование по Сэнгеру имеет ряд преимуществ, таких как высокая точность и надежность результатов, возможность анализа относительно небольших фрагментов ДНК или РНК.

Отличие метода секвенирование по Сэнгеру от секвенирование NGS

  • Метод секвенирования по Сэнгеру является традиционным методом исследования последовательности ДНК, в то время как NGS (Next Generation Sequencing) представляет собой современный метод, который позволяет анализировать миллионы фрагментов ДНК одновременно.
  • В методе секвенирования по Сэнгеру используется принцип терминированной полимеризации, в то время как в методе NGS используется параллельное секвенирование.
  • Метод секвенирования по Сэнгеру обычно используется для секвенирования коротких фрагментов ДНК, в то время как метод NGS позволяет секвенировать длинные фрагменты, а также проводить секвенирование генома целиком.
  • Метод секвенирования по Сэнгеру обычно требует значительного времени и ресурсов для проведения исследования, в то время как метод NGS позволяет получить результаты быстро и эффективно.
  • Метод NGS имеет более высокую стоимость обслуживания, чем метод секвенирования по Сэнгеру, однако он также обладает гораздо большей скоростью и эффективностью.

Рисунок 2

Рисунок 2.

          Таким разом, основное отличие между методами секвенирования по Сэнгеру и NGS заключается в том, что NGS представляет собой более современный и эффективный метод секвенирования, который позволяет проводить быстрое и масштабное анализирование генома. А метод секвенирования по Сэнгеру позволяет прочитывать нуклеотидную последовательность очень точно, что необходимо исследований, где требуется повышенная точностью. 

Приминение метода секвенирования по Сэнгеру

         Метод секвенирования по Сэнгеру широко используется в биологических и медицинских исследованиях для определения порядка нуклеотидов в ДНК или РНК. У этого метода есть несколько преимуществ, таких как высокая точность и надежность результатов, а также возможность анализировать короткие участки ДНК или РНК.

Прикладное использование метода секвенирования по Сэнгеру включает следующие области:

  • Генетика и геномика: метод секвенирования по Сэнгеру применяется для определения последовательности генов, мутаций и вариантов генома, что помогает в изучении генетических заболеваний и развитии персонализированной медицины.
  • Биоинформатика: результаты секвенирования по Сэнгеру могут быть использованы для разработки биоинформационных методов и инструментов для анализа и интерпретации генетической информации.
  • Эволюционная биология: секвенирование по Сэнгеру используется для изучения эволюционной истории организмов, идентификации генов, связанных с адаптацией и эволюцией, а также для построения филогенетических деревьев.
  • Диагностика и лечение заболеваний: метод секвенирования по Сэнгеру применяется в клинической медицине для диагностики генетических заболеваний, предсказания риска их развития, а также для выбора наилучшего метода лечения.

         В целом секвенирование по Сэнгеру играет важную роль в современной биологии и медицине, и его перспективы включают развитие новых методов и технологий для более быстрого и эффективного анализа генетической информации

Автоматизация метода секвенирования по Сэнгеру

Рисунок 3. Генетический анализатор по Сэнгеру

Рисунок 3. Генетический анализатор по Сэнгеру

Существует несколько способов автоматизации метода секвенирования по Сэнгеру. Один из них - использование роботизированных систем, которые могут автоматически подготавливать реакционные смеси, проводить электрофорез и анализировать результаты секвенирования. Такие системы позволяют повысить скорость и точность проведения секвенирования, а также снизить вероятность человеческих ошибок (рис 3).

         Также существуют специализированные программы и алгоритмы, которые могут автоматически обрабатывать и анализировать данные секвенирования по Сэнгеру, что позволяет ускорить процесс интерпретации результатов. Некоторые программы также могут автоматически подбирать оптимальные праймеры для секвенирования и проводить анализ мутаций и вариантов.

         Таким образом, автоматизация метода секвенирования по Сэнгеру позволяет значительно упростить и ускорить процесс исследования генома и анализа последовательностей ДНК.

          Биоинформатика - это область науки, которая объединяет биологию и информатику для изучения и анализа биологических данных, включая данные, полученные после секвенирования генома.

          После проведения секвенирования по Сэнгеру, данные о последовательности ДНК или РНК необходимо обработать и проанализировать с помощью различных биоинформатических методов. В частности, обработка данных после секвенирования по Сэнгеру включает в себя следующие этапы.

  • Контроль качества данных: проверка качества секвенированных ридов, удаление адаптеров и низкокачественных участков.
  • Сборка генома или транскриптома: сборка последовательностей ридов в одну комплексную сборку.
  • Анотация генома или транскриптома: идентификация генов, предсказание функций белков, анализ экспрессии генов и т.д.
  • Сравнение с другими геномами или транскриптомами: выявление геномных или транскриптомных различий между различными организмами или условиями.
  • Проведение функционального анализа: предсказание функций генов и путей метаболизма на основе последовательностей ДНК или РНК.
  • Визуализация результатов: представление данных в удобной форме для дальнейшего анализа и интерпретации.

           В целом обработка данных после секвенирования по Сэнгру играет ключевую роль в понимании геномной структуры и функции организма, помогает выявить гены, связанные с различными болезнями или фенотипическими признаками, и способствует развитию биомедицины и сельского хозяйства.

Микрофлюидное секвенирование Сэнгера

          Микрофлюидное секвенирование Сэнгера (microfluidic Sanger sequencing) - это метод секвенирования, который объединяет принципы микрофлюидики (технологии работы с малыми количествами жидкости) с технологией секвенирования Сэнгера (классический метод секвенирования ДНК.

          Этот метод позволяет проводить секвенирование ДНК с использованием малых объемов образцов, что позволяет сэкономить реагенты, уменьшить время анализа и повысить точность результатов. Микрофлюидика позволяет управлять малыми объемами жидкости на чипе, который содержит все необходимые компоненты для проведения реакции секвенирования.

         Таким образом, микрофлюидное секвенирование Сэнгера является эффективным и удобным методом для проведения секвенирования ДНК, который может быть использован в различных областях науки и медицины.

Определение нуклеотидной последовательности РНК методом секвенирования по Сэнгеру. 

Для определения нуклеотидной последовательности РНК методом Сэнгера необходимо выполнить следующие шаги.

  • Изолировать РНК из исследуемого образца.
  • Провести обратную транскрипцию, чтобы получить комплементарную ДНК (cDNA) на основе РНК.
  • Разделить полученные фрагменты cDNA с использованием электрофореза в агарозном геле
  • Реакция Сэнгера проводится с использованием дидезоксинуклеотидов (ddNTP), обеспечивающих остановку синтеза ДНК на каждом из четырех типов нуклеотидов (A, T, G, C), что позволяет определить последовательность нуклеотидов.
  • Полученные фрагменты образцов подвергаются анализу на автоматизированных ДНК-секвенаторах, которые определяют последовательность нуклеотидов.

Таким образом, метод Сэнгера позволяет определить последовательность нуклеотидов РНК с высокой точностью и надежностью

Некоторые из основных реактивов, которые используются при секвенировании по методу Сэнгера, включают:

  • ДНК-полимеразу: для синтеза комплементарной ДНК при наложении дезоксинуклеотидов на матричную цепь.
  • Dideoxynucleotides (ddNTPs): терминальные нуклеотиды, которые ингибируют продолжение синтеза ДНК цепи, когда они встроены в нее. Обычно используют коммерческие реактивы, например, Набор реагентов для проведения сиквенсовой реакции BD3 Cycle Sequencing Mix.
  • Деоксинуклеотиды (dNTPs): строительные блоки для синтеза новой ДНК цепи.
  • Праймеры короткие одноцепочечные ДНК олигонуклеотиды, используемые для инициации синтеза комплементарной ДНК цепи.
  • Буферы: для поддержания оптимального pH и ионной среды для реакции полимеразной цепной реакции. Пример буфера: Буфер для секвенирования 5Х, ADS.
  • Шаблонная ДНК: ДНК, подлежащая секвенированию и служащая матрицей для синтеза новой ДНК цепи.
  • Этилендиаминтетроуксусная кислота (EDTA): используется для инактивации ферментов, таких как ДНК-полимераза, после завершения реакции. Можно использовать и коммерческие наборы: Onelife XT Purification Kit, ADS.
  • Сахароза или полиамидамид (Polyethylene glycol): для очистки и концентрирования конечного продукта после реакции полимеразной цепной реакции.

К другим новостям магазина
Группа компаний Апекслаб
109518, г. Москва, ул. Грайвороновская, д. 13, стр. 1
+7(495)660-35-58
mail@snablab.ru